菟絲子-枸杞子對雷公藤多苷誘導精原細胞生精障礙模型增殖、凋亡的影響

王繼升 鮑丙豪 鄧 省 馮雋龍 李海松

北京中醫藥大學東直門醫院男科，北京 100700

[關鍵字]菟絲子；枸杞子；男性不育癥；增殖；凋亡

男性不育癥是指夫婦有規律性生活1 年以上，未采用避孕措施，由于男方因素造成女方無法自然受孕[1]。研究表明，有10%～15%的夫婦面臨不孕不育的困擾[2]。中醫學認為，腎精虧虛是導致男性生精功能障礙的重要病因[3-4]，而菟絲子-枸杞子藥對是臨床中常用的補腎填精藥物組合，在臨床上被廣泛用于少弱精子癥的治療[5-6]。

精原細胞是精子生成的基礎，本課題組既往研究表明，菟絲子-枸杞子可對精原細胞有修復作用[7-9]。本研究擬觀察菟絲子-枸杞子對精原細胞的增殖、周期及超微結構的治療作用，為補腎填精法治療男性不育癥提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

動物：北京維通利華有限公司提供6 周齡SPF 級雄性SD 大鼠20 只，體重（200±20）g，主要用于含藥血清制備，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，動物合格證號：1100111911000582。實驗實施、動物喂養均在北京中醫藥大學東直門醫院（以下簡稱“我院”）重點實驗室動物中心進行，飼養條件依照實驗室動物標準條件。

細胞：精原細胞購自武漢普諾賽公司（貨號：CL-0600），當細胞覆蓋率達70%～80%時，按1∶5 比例傳代培養，48 h 更換完全培養基。本研究通過我院動物倫理委員會審查（NO：19-27）。

1.2 主要試劑與儀器

雷公藤多苷（批號：130801，每片10 mg），左卡尼汀口服液（批號：130801），菟絲子-枸杞子免煎顆粒劑各15 g，均購自北京康仁堂股份有限公司。細胞凋亡（T2190）、細胞周期（CA1510）、線粒體膜電位（M8650）試劑盒均購自Solarbio 公司。

透射電子顯微鏡[日本Hitachi HT7700（80KV）]、全自動脫水機（沈陽譽德有限公司SYD-T2070）、石蠟包埋機（沈陽譽德有限公司SYD-B-F）、石蠟切片機（沈陽譽德有限公司SYD-S3020）、離心機（德國Eppendorf 公司Centrifuge 5415D）、超凈工作臺（中國東聯FLC-3 型）。

1.3 含藥血清制備

采用隨機數字表法將20 只大鼠分為空白組、雷公藤多苷組、左卡尼汀組、藥對組，每組5 只。分別予以去離子水[10 ml/（kg·d）]、雷公藤多苷[40 mg/（kg·d）]，左卡尼汀口服液[0.2 g/（kg·d）]、菟絲子-枸杞子藥對[0.45 g/（kg·d）]灌胃，每天上午10 點灌胃，連續7 d，末次灌藥的2 h 后麻醉，腹主動脈采血，取血清備用。

1.4 分組及干預

將細胞隨即分為四組：空白組、模型組、左卡尼汀組、藥對組，取對數生長期細胞接種到6 孔板中，每孔2 ml 完全培養基，接種密度為每孔2×105個細胞，24 h后更換相應培養基干預，具體如下：空白組予完全培養基，模型組、左卡尼汀組、藥對組首先用10%雷公藤多苷灌胃大鼠含藥血清制備生精功能障礙模型[10-11]，隨后左卡尼汀組、藥對組再分別予以左卡尼汀、菟絲子-枸杞子10%含藥血清干預。每個實驗組設6 個復孔，培養24 h 后收集相應細胞用于檢測。

1.5 細胞凋亡檢測

棄去原培養液，冷PBS 洗滌細胞2 次，用不含EDTA 的胰酶消化收集細胞，離心機離心（1 000 g，4℃，10 min），調整細胞濃度為1×106個/ml。加入500 μl Binding Buffer，1 000 g 離心5 min 后棄上清，再加入100 μl Binding Buffer 混勻后，分別加入5 μl AnnexinV-FITC 與10μlPI，室溫25℃避光反應25min，最后加入Binding Buffer，輕輕混勻后上機檢測。

1.6 細胞周期檢測

棄去原培養液，冷PBS 洗滌細胞2 次，用不含EDTA 的胰酶消化收集細胞，離心機離心（1 000 g，4℃，10 min）。加入1 ml PBS 重懸細胞，1 000 g 離心3 min，棄上清。加入500 μl PI/RNase 染色液，25℃避光孵育15 min 后上機檢測。

1.7 線粒體膜電位檢測

對數生長期的細胞待其完全貼壁后吸去上清液，PBS 洗滌細胞，在6 孔板中加入1 ml 細胞培養基及1 ml JC-1 染色工作液，充分混勻后于37℃細胞培養箱孵育20 min，棄去上清，每孔加入1 ml JC-1 染色緩沖液洗滌細胞3 次，最后棄上清，加入PBS 重懸細胞后上機檢測。

1.8 透射電鏡觀察細胞超微結構

含藥血清干預各組細胞48 h 后，棄培養基，先用PBS 沖洗2 遍，胰酶消化后加PBS 重懸細胞后移至EP 管，1 000 g 離心5 min 后，棄上清，收集細胞團塊，加入2.5%戊二醛，4℃冰箱過夜固定，隨后脫水、切片，透射電鏡下觀察。

1.9 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對所得數據進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗；計數資料采用例數表示。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡率比較

與空白組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。與模型組比較，藥對組細胞凋亡率顯著降低，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。見表1、圖1。

表1 各組細胞凋亡率比較（%，）

表1 各組細胞凋亡率比較（%，）

注 與空白組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bbP ＜0.01

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡

2.2 各組細胞G0/G1、S 和G2/M 期百分率比較

與空白組比較，模型組細胞的G0/G1和G2/M 期百分率顯著降低、S 期百分率顯著升高，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。與模型組比較，藥對組細胞的G0/G1和G2/M 期百分率顯著升高、S 期百分率顯著降低，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。見表2、圖2。

表2 各組細胞G0/G1、S 和G2/M 期百分率比較（%）

表2 各組細胞G0/G1、S 和G2/M 期百分率比較（%）

注 與空白組比較，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；與模型組比較，bbP ＜0.01

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞周期

2.3 各組細胞線粒體膜電位比較

與空白組比較，模型組細胞中線粒體膜電位顯著升高，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。與模型組比較，藥對組細胞中線粒體膜電位顯著降低，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。見表3、圖3。

圖3 流式細胞儀檢測各組細胞線粒體膜電位

表3 各組細胞線粒體膜電位比較（%，）

表3 各組細胞線粒體膜電位比較（%，）

注 與空白組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bbP ＜0.01

2.4 四組精原細胞超微結構損傷情況

空白組細胞的各細胞器形態結構正常，模型組細胞膜大面積破裂，細胞基質大面積密度減低，空泡變。細胞內眾多細胞器損傷，如細胞核形狀變形嚴重，局部凹陷；線粒體重度腫脹變形，嵴斷裂；粗面內質網明顯擴張；高爾基體肥大。左卡尼汀組和藥對組細胞膜結構完整，細胞基質大面積密度正常。細胞核形狀飽滿；線粒體結構完整；粗面內質網、高爾基體結構正常。見圖4。

圖4 電鏡觀察細胞器超微結構

3 討論

菟絲子-枸杞子藥對是補腎填精常用中藥組合，近年來有多項研究證明，菟絲子-枸杞子藥對可從多方面改善精子質量[12-14]。細胞周期是親代細胞分裂結束到子代細胞分裂結束所需的時間，其對于生精細胞的正常與否起到關鍵作用[15-16]。細胞周期由4 個階段組成，G0/G1期細胞處于DNA 復制過程之前；S 期細胞處于正在進行DNA 的復制，但是整個DNA 復制過程并沒有全部完成；G2/M 期細胞已經完成了DNA 復制過程[17]。本研究中，課題組發現菟絲子-枸杞子含藥血清干預后精原細胞G2/M 期比例明顯升高且細胞凋亡率明顯下降，提示菟絲子-枸杞子藥對含藥血清可能通過調節細胞周期的變化進而改善雷公藤多苷損傷的細胞。

本實驗結果提示，菟絲子-枸杞子藥對含藥血清可以改善線粒體膜電位水平同時修復線粒體及其他細胞器損傷。線粒體功能正常對于調控細胞周期和增殖具有重要作用[18]。作為細胞內生成腺苷三磷酸的主要場所，線粒體是促進細胞能量轉換的重要細胞器。線粒體膜電位耗損可嚴重影響線粒體功能，引起細胞凋亡率增加，線粒體膜電位是反映線粒體功能的重要指標[19-21]。在人類精子中，線粒體主要位于精子鞭毛中段，所產生的腺苷三磷酸為精子前向運動提供了必要的能量供應[22-24]。精子線粒體膜電位與精子活力、存活率和受精能力呈正相關，線粒體膜電位的下降意味著精子活動所必需的能量供應合成障礙，引起精子活力下降及生精細胞凋亡增加[25-28]。

綜上，本研究從線粒體膜電位、細胞周期與凋亡等方面入手，利用雷公藤多苷誘導生精功能障礙模型。研究發現菟絲子-枸杞子可以有效修復雷公藤多苷誘導的細胞超微結構損傷，抑制其凋亡，這可能與其調節精原細胞周期、改善細胞線粒體膜電位有關，但其具體作用機制仍有待進一步深入研究。