對常用消毒劑降解RNA/DNA病毒核酸效果的評估

張 浩，鄔銳軍，劉利軍，郝瑞軍，魏玉環，王建華，馬駿驥

（內蒙古正大食品有限公司，內蒙古 呼和浩特 010020）

隨著我國經濟的高速發展，規模化豬場快速興起，由此引發的豬病問題日益突出，嚴重制約了豬場的發展[1]。疫病不但能夠降低豬的生產性能，還能夠致使豬群大規模死亡，造成經濟損失[2]。良好的生物安全措施是控制疫病的關鍵，消毒是規模化豬場生物安全的重要措施之一[3]。豬場常見的病毒主要分為RNA病毒和DNA病毒，目前，常用的消毒劑對這2種病毒的消殺降解作用是否全面有效，很少有系統的研究。

核酸檢測在實驗室中最常見的問題就是核酸污染，這對核酸檢測的準確性有重大影響。使用何種消毒劑以及如何制定合理的消毒程序，成為PCR實驗室最需要重視的問題。RNA和DNA是大多數病毒的遺傳物質，檢測RNA和DNA含量是評價病毒滴度最節約時間和成本的有效方法之一。消毒后常用熒光定量PCR方法對農場及核酸檢測實驗室消毒效果進行評估。

本研究采用熒光定量PCR方法檢測84消毒劑（10%）、二氯異氰尿酸鈉（1∶200）、杜邦衛可（1∶200）、NaOH（2%）、NaOH（1%）、NaOH（0.5%）、微酸電解水、威特利劍（1∶400）、潔凈（1∶200）、戊二醛及 75%酒精這11種常規消毒劑對RNA病毒 （勃林格藍耳疫苗）和DNA病毒（海博萊偽狂犬疫苗）的核酸降解效果，以期為規模化養豬場的病毒防控實踐及PCR實驗室消毒流程規范和污染防控提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 消毒劑。84消毒劑 （有效成分次氯酸鈉）（10%）、二氯異氰尿酸鈉（1∶200）、杜邦衛可（過硫酸氫鉀復合物）（1∶200）、NaOH （2%）、NaOH （1%）、NaOH（0.5%）、微酸電解水、威特利劍（過硫酸氫鉀復合鹽）（1∶400）、潔凈（有效成分過氧乙酸）（1∶200）、戊二醛、75%酒精均注冊有獸藥產品批準文號，試驗時均在有效期內。

1.1.2 試驗疫苗選用。DNA病毒：海博萊偽狂犬疫苗（1頭份），RNA 病毒：勃林格藍耳疫苗（1頭份）。

1.1.3 主要試劑。DNA/RNA提取試劑盒，購于美國Axygen公司；Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，購于寶生物工程（大連）有限公司產品；豬偽狂犬病毒（gB基因）實時熒光PCR檢測試劑盒，購于北京世紀元亨公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，購于北京世紀元亨公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA病毒-勃林格藍耳疫苗消毒藥降解核酸效果試驗。將11種常規消毒劑與RNA病毒勃林格藍耳疫苗按40 mL消毒藥+400 μL疫苗的比例混合，模擬日常消毒過程，設置蒸餾水與疫苗等比例混合為對照組。消毒藥劑與RNA病毒反應時間分別為10 min、30 min、1 h、6 h、24 h 和 48 h，每個反應時間段內試驗重復2組，加入IPC（內部陽性質控品）全程控制試驗過程，排除殘留消毒藥對核酸提取及PCR反應造成的影響，篩選出消毒藥劑最適消毒效果反應時間及消毒最佳藥劑配比。

1.2.2 DNA病毒-海博萊偽狂犬疫苗消毒藥降解核酸效果試驗。將11種常規消毒劑與DNA病毒海博萊偽狂犬疫苗按40 mL消毒藥+400 μL疫苗的比例混合，模擬日常消毒過程。其余步驟同1.2.1。

1.2.3 病毒核酸提取。取200 μL上述產物，按病毒RNA/DNA提取試劑盒說明，提取各試驗組病毒核酸。

1.2.4 熒光定量PCR檢測。使用實時熒光RT-PCR檢測試劑盒進行核酸檢測。操作步驟嚴格按照各試劑盒說明書進行。豬藍耳病疫苗檢測采用豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒；偽狂犬病疫苗檢測采用豬偽狂犬病毒（gB基因）實時熒光PCR檢測試劑盒。

1.3 結果統計

按照以上步驟，重復處理各組樣品2次并檢測，統計平均Ct值。將各組檢測結果分別與對應陽性對照組比較，篩選出對核酸降解有效的消毒劑。

2 結果與分析

11種消毒劑對兩種病毒疫苗核酸降解效果的熒光定量PCR檢測結果如表1和表2所示。由表1和表2可知，84消毒劑、二氯異氰尿酸鈉、杜邦衛可及微酸電解水均可100%降解RNA及DNA病毒核酸；不同濃度的NaOH可100%降解RNA病毒核酸，對DNA病毒核酸無效；維特利劍、戊二醛、潔凈及酒精對病毒核酸降解作用不明顯。

表1 RNA病毒-勃林格藍耳疫苗（1頭份）熒光定量PCR平均Ct值

表2 DNA海博萊偽狂犬疫苗（1頭份）熒光定量PCR平均Ct值

3 討論

豬瘟、藍耳病、偽狂犬病、豬流行性腹瀉病和豬圓環病毒2型等都是豬群中傳播較為廣泛的傳染性疾病，長期以來給養豬業造成了嚴重的經濟損失[4-5]。再加上規模化養豬場的飼養密度過大以及頻繁引種，更加重了疾病的傳播。消毒的主要目的是通過消滅傳染源和切斷傳播途徑，阻止疫病的發生及蔓延，進而降低養殖場經濟的損失[6]。消毒劑的正確使用是預防養豬場病原感染和疫病暴發的關鍵。本試驗的創新點在于以藍耳病毒和偽狂犬病毒疫苗為試驗模型，評價常用的11種消毒劑對2種病毒的核酸降解效果，為養豬場及其他家畜養殖場的消毒程序提供理論依據。在利用熒光定量PCR檢測結果作為檢驗農場洗消效果的大背景下，有效地為農場篩選出能夠降解核酸的消毒劑，為科學評價洗消效果和降低生物安全風險提供科學依據。

近年來，隨著我國規模化豬場的不斷興起，越來越多的集團化企業開始自建實驗室，用于農場生物安全的風險評估和疾病預警。隨著實驗室的不斷增加，核酸污染防控問題也越來越受到管理人員的重視。尤其對于進行PCR診斷的實驗室來說，污染防控是直接影響檢測結果的重要因素。因此，我們進行了常見消毒劑的核酸降解評估。通過試驗結果可以看出，氯制劑（84消毒劑、二氯異氰尿酸鈉、杜邦衛可及微酸電解水）對核酸降解效果明顯，這可以幫助實驗室管理人員進行正確的消毒藥品篩選和使用，有效控制PCR檢測實驗室的核酸污染問題，提高檢測的準確性，同時也為實驗室消毒程序的制定提供科學依據。