復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)新生仔豬腸道功能紊亂的臨床療效研究

郭 愷，王旭紅 ，郭文華，李洪喆

（1.赤峰市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

新生仔豬腹瀉綜合征的病理?yè)p傷關(guān)鍵點(diǎn)為新生仔豬胃腸道黏膜屏障受損、離子通道失去調(diào)控功能及機(jī)體能量耗竭，最終消化道防御屏障被打破，病原體侵入引發(fā)混合感染。小檗堿又稱黃連素，是一種從小檗科、罌粟科、毛茛科及蕓香科等植物中提取所得的異喹啉類生物堿，也可通過(guò)人工合成獲得[1]。小檗堿具有良好的抗菌活性，對(duì)多種病原體有抑制作用，并對(duì)霍亂和大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素有抵抗作用。在臨床上小檗堿已被廣泛應(yīng)用于治療胃腸炎和腹瀉，尤其對(duì)細(xì)菌性腹瀉、腸道寄生蟲感染性腹瀉以及病毒性腹瀉等癥狀具有良好的改善效果[1-7]。

既往的研究認(rèn)為，小檗堿是通過(guò)抑菌作用來(lái)治療腹瀉，但這種說(shuō)法并不全面。因此，為了進(jìn)一步探討小檗堿治療腹瀉的作用機(jī)制，本試驗(yàn)通過(guò)研究復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)新生仔豬生長(zhǎng)性能、腹瀉程度、免疫功能及腸黏膜通透性的影響，探討復(fù)方小檗堿舔劑抗腹瀉的作用機(jī)理，從而降低新生仔豬的腹瀉發(fā)病率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

復(fù)方小檗堿舔劑由赤峰市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室研制，其主要成分為硫酸小檗堿、蒙脫石粉以及硫酸黏桿菌素等。試驗(yàn)新生仔豬購(gòu)自內(nèi)蒙古赤峰市某豬場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選用1日齡自然分娩杜大長(zhǎng)三元雜交仔豬24頭，體重（1.49±0.18）kg左右，隨機(jī)分為 3 組，每組 8頭。分別為對(duì)照組、黏桿菌素組及復(fù)方小檗堿舔劑組。黏桿菌素組、復(fù)方小檗堿舔劑組分別按照2 mL/kg劑量于第1、7及14天給藥，試驗(yàn)期21 d。試驗(yàn)期間，新生仔豬在產(chǎn)床保育箱內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)并進(jìn)行疫苗免疫。

1.3 樣品采集與測(cè)定

1.3.1 新生仔豬生長(zhǎng)性能的測(cè)定。在試驗(yàn)開始時(shí)測(cè)量仔豬初始體重，并在仔豬7、14及21日齡時(shí)，于早晨8：00稱重，記錄體重，計(jì)算平均日增重及增重速度。

1.3.2 仔豬免疫功能檢測(cè)。在第7、14及21天對(duì)仔豬進(jìn)行前腔靜脈采血，血清樣品在-20℃凍存待測(cè)。通過(guò)檢測(cè)仔豬血清免疫球蛋白（IgA、IgG及IgM）含量來(lái)評(píng)價(jià)免疫功能。血清中IgA、IgG及IgM采用免疫透射比濁法進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，利用邁瑞B(yǎng)S-800型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.3.3 腸黏膜通透性的血清學(xué)檢測(cè)。二胺氧化酶（DAO）可以作為腸黏膜通透性的標(biāo)志酶，其活性改變反映仔豬腸黏膜通透性變化。血漿中DAO的含量采用試劑盒測(cè)定，試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程有限公司，利用邁瑞B(yǎng)S-800型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.3.4 仔豬腹瀉程度的觀察。在第7、14及21天統(tǒng)計(jì)腹瀉率與腹瀉頻率。通過(guò)計(jì)算新生仔豬的腹瀉率與腹瀉頻率來(lái)測(cè)定仔豬的腹瀉程度。腹瀉相關(guān)計(jì)算公式：

腹瀉頻率/%=（腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù)）/（總頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù)）×100；

糞便指數(shù)=糞便評(píng)分之和/總頭數(shù)

1.3.5 復(fù)方小檗堿舔劑的臨床療效觀察。通過(guò)糞便評(píng)分定量反映新生仔豬腹瀉情況（表1）。當(dāng)新生仔豬糞便評(píng)分＞1時(shí)記為一個(gè)腹瀉日。當(dāng)新生仔豬糞便評(píng)分＞3時(shí)，證明腹瀉程度嚴(yán)重，判定為發(fā)生臨床腹瀉。試驗(yàn)全程觀察并記錄新生仔豬腹瀉情況，用腹瀉頻率和糞便指數(shù)等指標(biāo)反映腹瀉程度。

表1 新生仔豬腹瀉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

以腹瀉評(píng)分≥3的哺乳仔豬腹瀉病例為治療對(duì)象，選取1～7日齡腹瀉仔豬30頭、8～21日齡腹瀉仔豬60頭，共計(jì)90頭，口服藥物進(jìn)行治療試驗(yàn)，劑量為4 mL/kg體重，連續(xù)用藥5 d。5 d和10 d后分別統(tǒng)計(jì)腹瀉的治愈率及轉(zhuǎn)歸情況。

治愈率/%=恢復(fù)健康頭數(shù)/腹瀉病例總頭數(shù)×100

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)通過(guò)Excel作圖，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，采用單因子方差法分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)新生仔豬生長(zhǎng)性能的影響

2.1.1 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)新生仔豬體重的影響。試驗(yàn)期內(nèi)新生仔豬體重變化見(jiàn)表2。新生仔豬平均初生重為（1.49±0.18）kg。各組仔豬體重在第 7、14 和 21 天清晨無(wú)明顯差異（P>0.05），但復(fù)方小檗堿舔劑組的仔豬體重在一定程度上高于對(duì)照組和黏桿菌素組。

表2 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)新生仔豬體重的影響

2.1.2 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)新生仔豬增重速度的影響。新生仔豬體重增速見(jiàn)表3。分為3個(gè)時(shí)段進(jìn)行比較，分別為初生～第7天、第8～14天及第15～21天。由表3可知，各組間仔豬增重速度差異不顯著（P>0.05)。總體看來(lái)，初生至第7天仔豬增重速度為 [（108.52±58.78）g/（頭·d）]，第 8～14 天為[（180.78±61.95）g/（頭·d）]，第 15～21 天為[（270.64±65.83）g/（頭·d）]，各時(shí)段各組間差異均不顯著（P>0.05)。但復(fù)方小檗堿舔劑組仔豬的增重速度不僅在一定程度上高于其他各組，還高于總體的平均增速。

表3 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)新生仔豬增重速度的影響 g/(頭·d)

2.2 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)新生仔豬腹瀉程度的影響

由表4可知，與對(duì)照組和黏桿菌素組相比，復(fù)方小檗堿舔劑組在第7、14和21天未出現(xiàn)腹瀉仔豬。與對(duì)照組相比，黏桿菌素組的腹瀉頻率極顯著降低（P<0.01）。

表4 新生仔豬腹瀉程度的變化

2.3 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)新生仔豬免疫功能的影響

圖1A-C為各組IgA、IgG及IgM含量的變化。在第7、14和21天時(shí)，除第7天時(shí)IgM的含量與對(duì)照組和黏桿菌素組比較無(wú)顯著差異外（P>0.05），復(fù)方小檗堿舔劑組的IgA、IgG及IgM含量均顯著高于其余各組（P<0.05）。

圖1 仔豬血清免疫球蛋白含量的變化

2.4 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)新生仔豬腸黏膜通透性的影響

由圖2可知，復(fù)方小檗堿舔劑組DAO活性均低于同一時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組和黏桿菌素組，且呈現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01）。

圖2 仔豬腸道通透性檢測(cè)結(jié)果

2.5 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)新生仔豬腹瀉的臨床療效

2.5.1 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)腹瀉仔豬的抗腹瀉效果。由表5可知，對(duì)于仔豬腹瀉采用黏桿菌素與復(fù)方小檗堿舔劑治療均有效，但是黏桿菌素的臨床療效明顯低于復(fù)方小檗堿舔劑。1～7日齡腹瀉仔豬共治療30頭，其中黏桿菌素組治愈6頭，治愈率為60%，死亡2頭，死亡率為20%；復(fù)方小檗堿舔劑組治愈15頭，治愈率為75%，死亡3頭，死亡率為15%；8～21日齡腹瀉仔豬共治療60頭，其中黏桿菌素組治愈15頭，治愈率為75%，死亡2頭，死亡率為10%；復(fù)方小檗堿舔劑組治愈36頭，治愈率為90%，死亡 1頭，死亡率為2.5%。

表5 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)仔豬黃白痢的臨床治療效果

2.5.2 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)腹瀉仔豬腹瀉程度的測(cè)定結(jié)果。由表6可知，對(duì)于腹瀉病豬進(jìn)行黏桿菌素治療，效果雖較為明顯，但臨床復(fù)發(fā)率很高，糞便指數(shù)變化明顯。復(fù)方小檗堿舔劑治療組療效顯著，腹瀉頻率與黏桿菌素組相比極顯著降低（P<0.01），可見(jiàn)復(fù)發(fā)率得到了抑制。同時(shí)，與黏桿菌素組相比，復(fù)方小檗堿舔劑組的糞便指數(shù)極顯著降低（P<0.01），表明復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)健康仔豬的糞便影響較小。

表6 腹瀉仔豬腹瀉程度的變化

3 討論

3.1 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)新生仔豬增重的影響

通過(guò)3次給新生仔豬進(jìn)行口服應(yīng)用，結(jié)果顯示，復(fù)方小檗堿舔劑和黏桿菌素，在仔豬體重及增重速度方面影響較小，均無(wú)顯著性差異，但整體呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì)。小檗堿和硫酸黏桿菌素聯(lián)合應(yīng)用，既有營(yíng)養(yǎng)又具有抗菌、調(diào)節(jié)臟腑機(jī)能及增進(jìn)食欲等功效，現(xiàn)已常被用作畜禽飼料添加劑，能夠提高動(dòng)物生產(chǎn)力，減少動(dòng)物疾病的發(fā)生，同時(shí)具備無(wú)殘留的優(yōu)點(diǎn)[8-11]。

3.2 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)新生仔豬腹瀉程度的影響

小檗堿能夠降低由霍亂毒素引起的腸道水及電解質(zhì)的分泌[12]，并可殺死霍亂弧菌[13]。大腸桿菌的體外研究表明，硫酸小檗堿能夠抑制細(xì)菌黏附到黏膜或上皮表面，進(jìn)而抑制菌毛結(jié)構(gòu)的形成[14]。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿對(duì)福氏志賀菌Ⅱ型、痢疾志賀菌Ⅰ型、鮑氏志賀菌Ⅰ型和痢疾志賀菌Ⅱ型均有抑制作用[15]。本研究結(jié)果表明，黏桿菌素及復(fù)方小檗堿舔劑均可以有效預(yù)防新生仔豬腹瀉。復(fù)方小檗堿舔劑的主要成分為鹽酸小檗堿、黏桿菌素及蒙脫石，其中小檗堿和黏桿菌素能夠顯著抑制病原菌數(shù)量，而蒙脫石對(duì)致病菌有吸附作用，三者聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步發(fā)揮抗菌作用，表明鹽酸小檗堿、黏桿菌素及蒙脫石聯(lián)合應(yīng)用具有較強(qiáng)的預(yù)防腹瀉作用。

3.3 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)仔豬免疫功能的影響

免疫球蛋白主要為IgA、IgG和IgM 3種，初乳中免疫球蛋白主要是IgG，可占初乳免疫球蛋白的85%～90%，IgG是仔豬體液免疫的重要標(biāo)志。隨著仔豬日齡的增加，通過(guò)初乳吸收進(jìn)入仔豬體內(nèi)的母源抗體的作用會(huì)逐漸降低，仔豬的小腸逐漸發(fā)育成熟，腸道的黏膜免疫力逐漸增強(qiáng)，仔豬能夠獲得母源抗體的機(jī)會(huì)逐漸減少[16-18]。小檗堿具有顯著的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)也具有提高免疫力作用，能夠提高仔豬體內(nèi)免疫球蛋白的含量并穩(wěn)定其水平[19-20]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)仔豬血清中IgA、IgG及IgM含量影響趨勢(shì)基本一致，對(duì)照組隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，復(fù)方小檗堿舔劑組隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，而且IgA、IgG及IgM含量高于同一時(shí)間的對(duì)照組與黏桿菌素組，說(shuō)明復(fù)方小檗堿舔劑中的小檗堿和蒙脫石發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)的作用，能夠有效提高新生仔豬的免疫力。

3.4 復(fù)方小檗堿舔劑對(duì)仔豬腸道通透性的影響

血液中DAO的活性可間接反映腸黏膜的完整性及損傷程度，是監(jiān)測(cè)腸道屏障功能的關(guān)鍵指標(biāo)[21]。DAO是哺乳動(dòng)物小腸黏膜上層絨毛中的細(xì)胞內(nèi)酶，其高度酶活性與黏膜細(xì)胞的核酸和蛋白合成過(guò)程密切相關(guān)。當(dāng)腸道黏膜受損時(shí)，DAO從小腸黏膜釋放到血液中，使其血液中的含量顯著增加[22-23]。此前，大量研究對(duì)小檗堿的抗腹瀉機(jī)制進(jìn)行了探討，認(rèn)為小檗堿主要是通過(guò)參與抑制腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)并延遲腸道排空時(shí)間發(fā)揮抗腹瀉作用，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制腸平滑肌細(xì)胞膜表面特定的K+通道及依賴Ca2+激活的K+通道的開放，從而減少K+外流。抑制電壓門控Ca2+通道，減少胞內(nèi)Ca2+釋放，減少Ca2+內(nèi)流，影響胃腸道平滑肌的收縮耦聯(lián)[24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方小檗堿舔劑組的DAO活性均低于同一時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組和黏桿菌素組，而且呈現(xiàn)出極顯著差異。因此，復(fù)方小檗堿舔劑能夠有效調(diào)控離子通道及離子流向，抑制腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控腸黏膜通透性的作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，復(fù)方小檗堿舔劑能夠提高仔豬的生長(zhǎng)性能，降低新生仔豬的腹瀉率和腹瀉頻率，提高血清中免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）的含量，并有效地調(diào)控腸黏膜的通透性，治療新生仔豬腹瀉病。提示復(fù)方小檗堿舔劑可以提高新生仔豬免疫功能，調(diào)控腸黏膜的通透性，這可能是其抗腹瀉功效的重要機(jī)制之一。