宮腔粘連組織中miR-22、TGFβR1 表達與三維能量超聲參數的相關性及臨床意義

張友 王琮 楊燕

宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）是子宮內膜基底層破壞后出現的子宮壁之間的粘連，多見于人工流產、刮宮等宮腔操作后，會導致月經異常以及不孕。IUA 的常用治療手段是宮腔鏡下IUA 松解術或切除術，雖然手術操作的技術不斷進步，但手術操作仍不可避免會造成子宮內膜損傷并導致術后再次發生IUA［1-2］。細胞外基質沉積是IUA 發生發展的重要生物學特征，轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是調控細胞外基質代謝的關鍵細胞因子，其與TGF-β 受體1（TGF-β receptor 1，TGFβR1）結合后能夠促進細胞外基質的水解和異常沉積，進而促進組織纖維化及粘連［3］。國內一項研究證實，微小RNA（microRNA，miR）-22 是TGFβR1的上游調控分子，過表達miR-22能夠抑制TGFβR1并改善IUA大鼠的組織粘連［4］。為了進一步認識miR-22靶向調控TGFβR1在IUA 發病中的作用，本研究將以IUA 患者為對象，通過三維能量超聲評價組織粘連程度，分析IUA 組織中miR-22、TGFβR1表達與三維能量超聲參數的相關性及臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2018 年1 月至2020 年12 月于安徽理工大學第一附屬醫院接受IUA 分離術的48 例IUA患者作為IUA 組，納入標準：①符合指南中IUA 的診斷［5］；②存在月經異常和周期性腹痛；③接受宮腔鏡手術；④有妊娠需求。排除標準：①合并生殖系統先天畸形；②合并多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位癥等婦科疾??；③合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病等。選擇54 例接受宮腔鏡檢查的輸卵管性不孕患者作為對照組。IUA 組患者年齡21～44 歲、平均（31.25±5.49）歲，體質量指數（23.12±6.23）kg/m2；對照組患者年齡21～42 歲、平均（28.71±5.33）歲，體質量指數（22.89±6.82）kg/m2。兩組間一般資料的比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究取得醫院倫理委員會批準，獲得入組患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1miR-22、TGFβR1表達水平的檢測

取IUA 組和對照組的子宮內膜組織，采用總RNA 提取試劑盒提取組織中的RNA，采用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，采用熒光定量檢測試劑盒對cDNA 中的miR-22、TGFβR1進行熒光定量PCR 檢測。檢測的反應體系如下：cDNA 1 μL、試劑盒內反應混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL、去離子水7.8 μL；反應程序為：95℃預變性3 min 后95℃15 s、特異性退火溫度25 s、72℃30 s，重復40次。所用基因的引物序列及特異性退火溫度見表1。完成反應后得到循環曲線及循環閾值（Cycle threshold，Ct），以β-ɑctin為內參、按照公式2-ΔΔCt計算miR-22、TGFβR1的相對表達水平。

表1 miR-22、TGFβR1、β-ɑctin 的引物序列及退火溫度Table 1 Primer sequence and annealing temperature of miR-22，TGFβR1，β-ɑctin

1.2.2 子宮內膜三維能量超聲檢查

采用三維多普勒超聲儀對兩組患者進行三維能量超聲檢查，探頭頻率3～9 MHz，首先進行常規超聲探查，顯示子宮最大縱切面后固定該平面，啟動能量多普勒模式，取樣框比子宮略大、將子宮完全包繞，啟動三維功能鍵并勾勒子宮內膜輪廓，檢測體積（Volume，V）、血管指數（vascular index，VI）、血流指數（flow index，FI）、血管血流指數（vascular flow index，VFI）。

1.2.3 IUA 嚴重程度及預后的評估

參照指南［5］中Nasr 宮腔粘連分級評估IUA 嚴重程度，從峽部粘連、膜狀粘連、致密粘連、輸卵管開口、管狀宮腔、月經類型、孕產史進行評分，計算總得分，0～4 分為輕度、5～10 分為中度、11～22 分為重度。根據妊娠情況評價IUA 患者的預后，共隨訪2 年。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學處理，計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗進行兩組間比較，采用Pearson 檢驗進行相關性分析，采用K-M 曲線及log rank 檢驗分析累積妊娠率的差異。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IUA 組與對照組miR-22、TGFβR1 表達水平的比較

IUA 組局部組織中miR-22的相對表達水平低于對照組，TGFβR1的相對表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 IUA組與對照組miR-22、TGFβR1表達水平的比較（±s）Table 2 Comparison of miR-22 and TGFβR1 expression levels between IUA group and control group（±s）

表2 IUA組與對照組miR-22、TGFβR1表達水平的比較（±s）Table 2 Comparison of miR-22 and TGFβR1 expression levels between IUA group and control group（±s）

組別IUA 組對照組t 值P 值n 48 54 miR-22 0.66±0.17 1.00±0.22 5.489 0.000 TGFβR1 1.29±0.25 1.00±0.28 8.653 0.000

2.2 IUA 組miR-22、TGFβR1 表達水平的相關性

IUA 組局部組織中miR-22的相對表達水平與TGFβR1的相對表達水平呈負相關，相關系數為-0.4146。見圖1。

圖1 IUA 組miR-22、TGFβR1 表達水平的相關性Figure 1 Correlation of miR-22 and TGFβR1 expression level in IUA group

2.3 IUA 組中不同嚴重程度患者miR-22、TGFβR1表達水平的比較

IUA 組中中重度患者局部組織中miR-22的相對表達水平低于輕度患者，TGFβR1的相對表達水平高于輕度患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 IUA 組中不同嚴重程度患者miR-22、TGFβR1 表達水平的比較（±s）Table 3 Comparison of miR-22 and TGFβR1 expression levels among patients with different severity（±s）

表3 IUA 組中不同嚴重程度患者miR-22、TGFβR1 表達水平的比較（±s）Table 3 Comparison of miR-22 and TGFβR1 expression levels among patients with different severity（±s）

嚴重程度輕度中重度t 值P 值n 26 22 miR-22 0.75±0.22 0.55±0.19 3.171 0.003 TGFβR1 1.10±0.24 1.52±0.32 4.640 0.000

2.4 IUA 組與對照組三維能量超聲參數的比較

IUA 組患者子宮內膜的三維能量超聲參數V、VI、FI、VFI 均低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 宮腔粘連的超聲圖像Figure 2 ultrasonic image of intrauterine adhesion

表4 IUA 組與對照組三維能量超聲參數的比較（±s）Table 4 Comparison of three-dimensional energy ultrasonic parameters between IUA group and control group（±s）

表4 IUA 組與對照組三維能量超聲參數的比較（±s）Table 4 Comparison of three-dimensional energy ultrasonic parameters between IUA group and control group（±s）

組別IUA 組對照組t 值P 值n 48 54 V（cm3）3.41±0.62 4.49±0.77 7.739 0.000 VI（%）3.74±0.89 4.71±0.94 5.333 0.000 FI 23.09±4.51 26.65±6.44 3.195 0.000 VFI 1.16±0.25 1.49±0.31 5.870 0.000

2.5 IUA 組miR-22、TGFβR1 表達水平與三維能量超聲參數的相關性

IUA 組患者局部組織中miR-22的相對表達水平與V、VI、FI、VFI 呈正相關，TGFβR1的相對表達水平與V、VI、FI、VFI 呈負相關。見表5。

表5 IUA 組miR-22、TGFβR1 表達水平與三維能量超聲參數的相關性Table 5 Correlation between miR-22，TGFvR1 expression level and three-dimensional energy ultrasonic parameters in IUA group

2.6 IUA 組miR-22、TGFβR1 表達水平與預后的關系

IUA 組中不同miR-22、TGFβR1表達水平的患者累積妊娠率的K-M 曲線見圖3。經log-rank 檢驗：IUA 組中miR-22表達≥中位數患者的2 年累積妊娠率高于miR-22表達＜中位數患者，TGFβR1表達≥中位數患者的2 年累積妊娠率低于TGFβR1表達＜中位數患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 K-M 曲線Figure 3 K-M curve

3 討論

IUA 分離術及切除術是治療IUA 的常用手段，能夠有效分離或清除粘連的宮腔組織，但手術操作也不可避免會造成子宮內膜損害，術后IUA復發的風險較高［6-7］。

成纖維細胞過度增殖、纖維結締組織異常增生是與IUA 發生密切相關的生物學環節，參與該環節的關鍵調控分子是TGF-β。TGFβR1是介導TGF-β 生物學效應的膜受體，能夠招募下游Smad3 并促進膠原蛋白、層黏連蛋白合成，進而導致組織纖維化的發生［8-10］。一項動物實驗通過刮宮術建立了IUA 大鼠模型，IUA 大鼠內膜組織中TGFβR1的表達水平明顯增加［4］，提示TGFβR1的高表達與IUA 的發生有關。本研究對IUA 患者進行了檢測，與正常子宮內膜組織比較，IUA 子宮內膜組織中TGFβR1的表達水平增加，與上述研究結果一致。進一步通過Nasr 宮腔粘連分級評估IUA 嚴重程度并分析可知：中重度IUA 患者子宮內膜組織中TGFβR1的表達水平高于輕度IUA 患者，結果表明TGFβR1表達增加與IUA 的發生及粘連程度的加重有關。

TGFβR1表達的上游調控機制復雜，其中miRs能夠在轉錄后水平調控基因表達［11］，多項研究證實TGFβR1是miR-22的下游靶基因之一［12-13］。本研究對IUA 患者進行了檢測，與正常子宮內膜組織比較，IUA 子宮內膜組織中miR-22的表達水平降低，與IUA 大鼠中miR-22減輕粘連的生物學作用吻合；同時，miR-22的表達與TGFβR1呈負相關，中重度IUA患者子宮內膜組織中miR-22的表達水平低于輕度IUA 患者。以上結果表明miR-22表達降低與IUA 的發生及粘連程度的加重有關，并且miR-22可能通過靶向調控TGFβR1的參與IUA 的發病。

超聲檢查是臨床診斷IUA 并評估病情的常用手段，三維能量超聲是新的超聲檢查技術，相關的超聲特征包括宮腔縮小、子宮內膜容積減小以及粘連組織中血流灌注不足［14］。隨著IUA 病情加重，上述超聲變化更加顯著。本研究對IUA 患者進行了三維能量超聲檢查，結果顯示：與對照組比較，IUA 患者子宮內膜的V、VI、FI、VFI 均降低，符合IUA 發病過程中子宮內膜容積減小以及血流灌注不足的特征［14］。進一步在IUA 患者中進行相關性分析可知：miR-22的表達水平與超聲參數V、VI、FI、VFI 呈負相關，TGFβR1的表達水平與超聲參數V、VI、FI、VFI 呈正相關，表明IUA 發病過程中miR-22及TGFβR1表達的變化會加重子宮內膜容積減小以及血流灌注不足。

miR-22及其靶向調控的TGFβR1參與成纖維細胞增殖及組織纖維化的調控，兩者異常表達可能在術后促進子宮內膜纖維化的發生、嚴重者出現IUA 復發，進而影響妊娠。本研究對IUA 患者的妊娠情況進行了隨訪，分析其與miR-22、TGFβR1表達的關系，結果顯示，miR-22表達降低、TGFβR1表達增加會導致累積妊娠率顯著降低。

綜上所述，IUA 組織中miR-22低表達、TGFβR1高表達存在相關性，同時兩者表達的變化與粘連加重、子宮內膜體積縮小及血流灌注減少、妊娠預后不良有關。