泥胡菜不同極性溶劑萃取物中總酚和總黃酮含量及抗氧化活性測定

朱瑩，陳達鑫，王美玲，林珊*

（1.福建衛(wèi)生職業(yè)技術學院，福建 福州 350101；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

泥胡菜Hemisteptia lyrataBunge為菊科泥胡菜屬植物，廣泛分布于我國各地，具有清熱解毒、消腫祛瘀的作用，臨床上已有報道可用來治療痔漏、癰腫、疔瘡、外傷出血和骨折等疾病［1］。泥胡菜主要化學成分為黃酮、甾醇和木脂素等［2-7］。研究表明癌癥、動脈硬化、糖尿病等疾病的發(fā)生和發(fā)展與過剩的活潑氧自由基有關［8-9］，而多酚類和黃酮類化合物具有抗氧化和清除自由基的作用［10-11］。泥胡菜能抑制80%氯仿（CCl4）酒精溶液所誘導的小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化，具有良好的抗氧化活性［12］。但目前尚未報道對泥胡菜有效成分進行抗氧化實驗研究。所以本實驗通過對泥胡菜不同極性溶劑萃取物進行總酚及總黃酮的含量測定，采用不同反應機制的抗氧化方法，對不同提取物的抗氧化活性能力進行全面的評價。探討不同萃取物的抗氧化作用，分析不同抗氧化活性指標與總酚、總黃酮含量之間的關聯(lián)，為泥胡菜臨床應用提供理論依據(jù)，為尋找天然的抗氧化劑提供新的途徑，并為下一步合理開發(fā)和利用泥胡菜藥材資源提供參考。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 泥胡菜樣品采自福建省永春縣，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學楊成梓教授鑒定為菊科植物泥胡菜Hemisteptia lyrataBunge。沒食子酸、蘆丁對照品（純度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司）；維生素C（上海源葉生物科技有限公司）；福林酚試劑（北京索萊寶科技有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、氯化硝基四氮唑藍（NBT）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、水楊酸試劑（美國Sigma公司）；碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、乙醇等所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 UV-1800紫外可見分光光度計（日本Shimadzu公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵、RZ01C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、HH-S恒溫水浴鍋（鄭州長城科技工貿(mào)有限公司）；SFG-02B電熱恒溫鼓風干燥箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AR2130電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；CP225D電子天平（德國Sartorius公司）；Elix5純水制備系統(tǒng)（廈門精藝興業(yè)科技有限公司）。

2 方 法

2.1 不同萃取部位提取物制備 精密稱取泥胡菜全草干燥粗粉300 g，加10倍量50%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，減壓回收至無乙醇，3 600 r/min離心10 min，上清液濃縮至干，得乙醇浸膏，備用。取適量乙醇浸膏，加入10倍量的超純水超聲溶解，依次用10倍量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯及水飽和正丁醇分別萃取3次，合并萃取液，減壓回收溶劑，濃縮蒸干，得到各萃取部位的浸膏，備用。

2.2 總酚含量測定

2.2.1 標準曲線制備 精密稱量沒食子酸對照品4.10 mg，置于25 mL量瓶中，加入適量60%乙醇，超聲處理至完全溶解，加60%乙醇至刻度，得到0.164 mg/mL 沒食子酸對照品溶液。精密吸取對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL置于10 mL具塞刻度試管，加蒸餾水3 mL，加10%福林酚試劑2.5 mL，加7.5% 碳酸鈉溶液2 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，暗處放置30 min 后，采用紫外分光光度法于742 nm波長處測吸光度值。以吸光度值為縱坐標，對照品的濃度為橫坐標，繪制標準曲線為Y＝86.95X＋0.004 6，r2＝0.999 7，線性關系良好。

2.2.2 樣品總酚測定 將各受試樣品用超純水分別配制成5.10 mg/mL乙醇浸膏溶液、10.03 mg/mL石油醚浸膏溶液、5.06 mg/mL氯仿浸膏溶液、2.54 mg/mL乙酸乙酯浸膏溶液和飽和5.04 mg/mL正丁醇浸膏溶液，分別從中精密吸取0.10 mL置于10 mL具塞刻度試管，按“2.2.1”項下的方法進行含量測定，取3次平均值，計算樣品中總酚含量。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 標準曲線制備 精密配制0.2 mg/mL蘆丁對照品60%乙醇溶液。吸取對照品溶液 1、2、4、6、8 mL，分別置于25 mL量瓶中，各加5%的亞硝酸鈉0.75 mL，搖勻靜置5 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.75 mL，搖勻靜置5 min，再加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻后用60%乙醇稀釋至刻度，靜置10 min后用紫外分光光度法在510 nm進行測定，以水為空白對照，測定吸光度。以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y＝10.156X＋0.024 8，r2＝0.999 8，線性良好。

2.3.2 樣品總黃酮測定 將各受試樣品加入60%乙醇配制成5 mg/mL石油醚浸膏溶液、5 mg/mL氯仿浸膏溶液、2 mg/mL乙酸乙酯浸膏溶液和5 mg/mL飽和正丁醇浸膏溶液，分別從中精密吸取1 mL置于25 mL容量瓶，按“2.3.1”項下的方法進行含量測定，取3次的平均值，計算樣品中總黃酮含量。

2.4 DPPH清除率測定 加入不同質(zhì)量濃度受試樣品（0.1～0.5 mg/mL）1 mL及0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液3 mL，搖勻，室溫避光反應20 min 后，于517 nm處測定吸光度值A1，樣品溶劑代替樣品溶液測吸光值A0，維生素C（0.1～0.5 mg/mL）做陽性對照。根據(jù)公式計算清除率＝（A0－A1）/A0×100%，計算半數(shù)抑制濃度IC50。

2.5 羥自由基清除率測定 加入不同質(zhì)量濃度受試樣品（0.1～0.5 mg/mL）0.5 mL、1 mmol/L的FeSO4溶液2 mL及1 mmol/L H2O2溶液3 mL，混勻，加入1 mmol/L水楊酸溶液3.5 mL，混勻后置于37 ℃水浴中恒溫保持15 min，于510 nm波長處測定吸光值A1，樣品溶劑代替樣品溶液測吸光值A0，維生素C（0.1～0.5 mg/mL）做陽性對照。根據(jù)公式計算清除率＝（A0－A1）/A0×100%，計算半數(shù)抑制濃度IC50。

2.6 超氧陰離子自由基清除率測定 加入不同質(zhì)量濃度受試樣品（0.2～1.0 mg/mL） 1 mL、0.2 mmol/mL的NBT溶液1 mL和0.5 mmol/mL的NADH溶液1 mL，最后加入0.2 mmol/L的PMS溶液0.4 mL，搖勻，室溫靜置5 min后，于560 nm處測定吸光度值A1，樣品溶劑代替樣品溶液測吸光值A0，維生素C（0.2～0.6 mg/mL）做陽性對照。根據(jù)公式計算清除率＝（A0－A1）/A0×100%，計算半數(shù)抑制濃度IC50。

2.7 鐵離子還原能力測定 加入不同質(zhì)量濃度受試樣品（0.2～1.0 mg/mL）1 mL、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值6.6） 2.5 mL及1%鐵氰化鉀溶液定容至2.5 mL，50 ℃水浴中保溫20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混勻，靜置10 min。取上清液2.5 mL，加入0.1% FeSO4溶液0.5 mL，靜置10 min，于700 nm處測定吸光值A1，樣品溶劑代替樣品溶液測吸光值A0，維生素C（0.05～0.25 mg/mL）做陽性對照。以吸光值大小表示還原能力大小A＝A1－A0。

2.8 統(tǒng)計學方法 所有實驗數(shù)據(jù)至少重復3次，計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示。應用Graphpad prism 6.0軟件繪制濃度依賴曲線圖及其對應的IC50柱狀圖，根據(jù)均值評估泥胡菜不同極性部位的抗氧化能力。

3 結(jié) 果

3.1 總酚和總黃酮含量 結(jié)果表明，泥胡菜不同萃取部位浸膏得率不同，總酚和總黃酮的含量也各有差異，其中乙酸乙酯部位提取率最低，但浸膏中總酚和總黃酮含量最高。泥胡菜不同極性部位中總酚含量從高至低依次為乙酸乙酯＞正丁醇＞氯仿＞石油醚；總黃酮含量從高至低依次為乙酸乙酯＞氯仿＞正丁醇＞石油醚，見表1。從表中還可以看出，用低極性或高極性溶劑萃取所得黃酮類和酚類化合物的含量比中極性溶劑萃取所得要低。同時，總酚＋總黃酮含量，乙酸乙酯部位最高，氯仿和正丁醇相近，石油醚部位最低。綜上所述，乙酸乙酯最適用于泥胡菜中酚類和黃酮類化合物的提取。

表1 泥胡菜不同極性溶劑萃取部位總酚和總黃酮含量比較（±s） %

表1 泥胡菜不同極性溶劑萃取部位總酚和總黃酮含量比較（±s） %

提取部位石油醚浸膏氯仿浸膏乙酸乙酯浸膏正丁醇浸膏提取率/%1.30 0.75 0.42 1.17總酚含量（以沒食子酸計）4.08±0.46 14.79±0.58 55.04±0.58 20.83±0.75總黃酮含量（以蘆丁計）12.36±4.32 19.90±5.12 62.11±4.97 15.40±4.92

3.2 清除DPPH自由基能力 由圖1A可得，不同部位均有較強的清除DPPH自由基的作用。當質(zhì)量濃度在0.1～0.5 mg/mL時，抗氧化活性隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而增強，但抗氧化能力均低于陽性對照維生素C。乙酸乙酯和氯仿部位的清除能力較接近，石油醚和正丁醇比較接近。由圖1B可見，乙酸乙酯部位清除DPPH自由基能力最高，IC50值最低，清除能力是乙酸乙酯＞氯仿＞正丁醇＞石油醚。比較各部位總酚及總黃酮含量可知，不同萃取部位清除DPPH自由基能力與其總黃酮及總酚的量在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴。

圖1 泥胡菜不同極性溶劑萃取物清除DPPH自由基能力

3.3 清除羥基自由基能力 由于羥自由基極強的氧化性能，對羥自由基的清除能力是反映藥物抗氧化作用的重要指標之一。由圖2A可知，泥胡菜不同極性溶劑萃取物都表現(xiàn)出一定的羥基自由基清除活性。在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.1～0.5 mg/mL），不同萃取部位清除羥基的能力隨著樣品濃度的增大而表現(xiàn)出增強的趨勢。乙酸乙酯部位表現(xiàn)出最高的羥基自由基清除能力，氯仿、正丁醇和石油醚部位的清除能力較接近。由圖2B可得，根據(jù)IC50值可知清除羥基自由基能力是乙酸乙酯＞氯仿＞正丁醇＞石油醚。不同萃取部位清除羥基自由基的能力與其總黃酮及總酚的量在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴。

圖2 泥胡菜不同極性溶劑萃取部位清除羥基自由基能力

3.4 清除超氧自由基能力 通過NADH-PMS-NBT體系檢測超氧陰離子清除活性，由圖3A可以看出，泥胡菜不同萃取部位清除超氧自由基作用最強是乙酸乙酯部位，但明顯低于維生素C，不同萃取部位抗氧化活性隨濃度呈現(xiàn)量效關系。由圖3B可得，根據(jù)不同萃取部位超氧陰離子自由基IC50可知，清除能力是乙酸乙酯＞氯仿＞正丁醇＞石油醚。

圖3 泥胡菜不同極性溶劑萃取部位清除超氧自由基能力

3.5 還原能力 抗氧化劑是通過自身的還原作用清除自由基，還原力越大，抗氧化性越強。由此可根據(jù)還原力的大小來判斷其抗氧化活性的大小，吸光度越大，表明還原能力越強。從圖4可以看出，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，還原力不斷增強，且濃度與還原力呈正相關。當質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時，泥胡菜不同萃取部位的還原能力吸光值分別為石油醚（0.018±0.001）、氯仿（0.043±0.010）、乙酸乙酯（0.077±0.018）和正丁醇（0.026±0.007），而在相同質(zhì)量濃度下，陽性對照維生素C可達到（1.593±0.202）。可見不同萃取部位的還原能力遠低于陽性對照維生素C。在各受試質(zhì)量濃度下，各樣品還原能力相近，這表明泥胡菜不同萃取部位提取物對還原能力影響小。

圖4 泥胡菜不同極性溶劑萃取部位還原能力

4 討 論

泥胡菜為福建省特色藥材之一，民間全草入藥，始載于《救荒本草》。本系列研究在前期運用色譜指紋圖譜技術和開展福建泥胡菜抗乳腺癌活性篩選的基礎上，進一步闡明泥胡菜抗氧化的活性成分部位與藥效之間的相關性，應用于泥胡菜質(zhì)量控制，為追蹤分離目標活性成分和開發(fā)中藥新藥提出新的思路和方法，對提高泥胡菜的藥用價值和促進海西建設都具有重大意義。

本研究基于已有文獻進行條件優(yōu)化［13-14］，泥胡菜不同溶劑萃取物的抗氧化能力存在明顯差異，根據(jù)極性不同，將泥胡菜的提取部位分為石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇，其成分有倍半萜內(nèi)脂類、木脂素類、黃酮類、酚類及內(nèi)脂類化合物。其中山奈酚、芹菜素和金合歡素為泥胡菜主要的黃酮類成分，已有文獻報道其具有一定抗氧化作用［15-17］。如山奈酚可降低高糖對腎小球系膜細胞的氧化應激作用，其氧化機制是通過降低尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（recombinant nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）的活性所介導［15］。因此，泥胡菜具有抗氧化作用，但目前未見報道。由本實驗結(jié)果可知，泥胡菜具有較好的清除DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子的能力，但對還原能力影響較小。同時隨樣品質(zhì)量濃度的增大，不同萃取物在不同氧化體系中抗氧化能力都呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢。尤其是乙酸乙酯萃取部位總酚和總黃酮的含量最高，其在不同氧化體系中抗氧化能力也是最高；氯仿和正丁醇部位總黃酮和總酚含量相近，其抗氧化作用也相似，二者之間的抗氧化作用無明顯差異，均低于乙酸乙酯部位的抗氧化活性；石油醚部位總酚和總黃酮的含量最低，其抗氧化能力也最低。結(jié)果可知，泥胡菜的抗氧化能力與泥胡菜總酚和總黃酮的含量有關。黃酮類和酚類化合物是具有較強抗氧化活性的一類物質(zhì)，從實驗結(jié)果可得，不同部位提取物濃度與抗氧化能力呈濃度依賴，提示酚類和黃酮類化合物可能是泥胡菜抗氧化作用的主要成分。

上述結(jié)果看出，采用化學成分分析和生物活性相結(jié)合的方式，能夠更加全面、準確地評估藥材的質(zhì)量，豐富了泥胡菜的基礎研究，為藥材的開發(fā)和應用提供參考。并且有必要進一步分析泥胡菜的黃酮及酚類化合物活性成分，明確構效關系，探討抗氧化機理，為指導臨床的合理用藥提供依據(jù)。