肉芽腫性乳腺炎患者結核硬脂酸棒狀桿菌毒力因子和耐藥性分析

宋皓月， 舒 文

（上海市第一人民醫院檢驗醫學中心，上海 201620）

棒狀桿菌屬于革蘭陽性菌，大多為條件致病菌。結核硬脂酸棒狀桿菌因可產生結核硬脂酸（10-甲基十八烷酸）而有別于其他棒狀桿菌[1]，臨床較為少見。近年來，隨著分離、鑒定水平的提高，國外已有關于結核硬脂酸棒狀桿菌引起肉芽腫性乳腺炎的報道[2-3]，但我國尚未見相關報道。本研究對分離自肉芽腫性乳腺炎患者膿液樣本的結核硬脂酸棒狀桿菌的耐藥性和毒力因子攜帶情況進行分析，為臨床診治此類少見菌感染提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集1株上海市第一人民醫院分離自無菌環境下穿刺抽取的乳腺膿液樣本的棒狀桿菌。質控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎鏈球菌（ATCC 49619）購自上海市臨床檢驗中心。

1.2 方法

將穿刺所得乳腺膿液樣本接種于血瓊脂平板（上海科瑪嘉微生物技術有限公司），35 ℃5% CO2培養48 h，觀察菌落形態。將膿液樣本分別注入需氧和厭氧血培養瓶（美國BD公司）培養5 d，采用法國生物梅里埃公司VITEK MS微生物質譜鑒定系統對培養所得微生物進行鑒定，并進行全基因組測序。采用紙片擴散法和E-試驗對培養所得微生物進行藥物敏感性檢測；E-試驗紙條購自杭州康泰公司，相關藥物敏感性紙片購自英國Oxoid公司。萬古霉素、環丙沙星、利福平、利奈唑胺、亞胺培南、美羅培南藥物敏感性結果參照美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute ，CLSI）M45-A文件[4]標準解讀；青霉素、四環素藥物敏感性結果參照2021年歐洲藥物敏感性試驗委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）[5]標準解讀；頭孢類藥物敏感性結果參照CLSI M100文件[6]中鏈球菌屬的標準解讀，慶大霉素、左氧氟沙星藥物敏感性結果參照CLSI M100文件[6]中金黃色葡萄球菌的標準解讀。

2 結果

2.1 微生物培養結果

穿刺所得膿液樣本于血瓊脂平板35 ℃ 5%CO2環境培養48 h后，可見白色、乳酪樣、無溶血的小菌落（圖1）。該菌于厭氧環境中可生長。膿液樣本在需氧和厭氧的血培養瓶培養5 d未見菌落生長。

圖1 膿液樣本培養48 h菌落形態

2.2 革蘭染色結果

挑取培養所得菌落，革蘭染色后于鏡下觀察，可見革蘭陽性短桿菌，排布散亂，呈并列或V字形排列。見圖2。

圖2 培養陽性菌落革蘭染色鏡下形態（×1 000）

2.3 菌株鑒定結果

MALDI-TOF MS鑒定結果顯示，根據特征峰解讀，該菌株為結核硬脂酸棒狀桿菌（置信度99.9%）。見圖3。

圖3 結核硬脂酸棒狀桿菌MALDI-TOF MS 質譜圖

2.4 藥物敏感性試驗結果

該結核硬脂酸棒狀桿菌在MH瓊脂平板不生長，藥物敏感性分析結果顯示，該菌株對紅霉素、克林霉素、復方磺胺甲噁唑、磷霉素表現為耐藥，對左氧氟沙星表現為中介，對其他抗菌藥物均表現為敏感。見表1。

表1 結核硬脂酸棒狀桿菌藥物敏感性分析結果

2.5 耐藥基因和毒力因子分析結果

全基因組測序結果顯示，該結核硬脂酸棒狀桿菌攜帶多種耐藥基因和毒力因子。耐藥基因包括β-內酰胺類耐藥基因blaTEM、大環內酯類耐藥基因erm（X）、氟喹諾酮類耐藥基因gyrA和gyrB、利福平耐藥基因rpoB和rbpA、氨基糖苷類耐藥基因TlyA和rpsL、鏈霉素耐藥基因rpsL和gidB。毒力因子包括鐵離子調控蛋白DtxR、（p）ppGpp合成相關蛋白RelA、雙組分信號轉導系統TcrX和PhoP、菌毛組分蛋白SpaE和SpaF。

3 討論

一般情況下，結核硬脂酸棒狀桿菌在人體皮膚和黏膜表面作為一種正常定植菌存在。有研究結果顯示，該菌可能導致炎癥性乳房疾病、胰腺脂膜炎、慢性鼻竇炎和手術部位感染等[7]。本研究中，乳腺穿刺膿液在需氧和厭氧血培養瓶內培養5 d仍為陰性，與相關文獻[8]結果一致。可能與結核硬脂酸棒狀桿菌的親脂性有關，血培養瓶中主要的營養物質為大豆酪蛋白消化肉湯，不能為該菌株的生長提供豐富的脂質，不利于其生長。

本研究中的結核硬脂酸棒狀桿菌分離自1例肉芽腫性乳腺炎患者乳腺膿液樣本。目前，肉芽腫性乳腺炎的發病機制尚不完全明確，可能與自身免疫、細菌或病毒感染等有關。有研究發現，棒狀桿菌屬可能參與了超敏反應，并誘導了肉芽腫的形成[9-10]。

常規實驗室理化檢測鑒定棒狀桿菌屬存在一定困難，需要使用MALDI-TOF-MS或其他更為先進的鑒定方法。本研究在分離菌株后，采用MALDI-TOF-MS進行鑒定，置信度為99.9%。

因棒狀桿菌尚無明確、全面的藥物敏感性判斷折點，本研究聯用多種標準，以進行更合理的結果判讀，結果顯示，分離的菌株對紅霉素、克林霉素、復方磺胺甲噁唑、磷霉素均耐藥，對左氧氟沙星中介，對β-內酰胺類（青霉素、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢噻肟、亞胺培南、美羅培南）和慶大霉素、萬古霉素、利奈唑胺等均表現為敏感，與相關文獻[8]結果基本一致。本研究全基因組測序分析發現該菌攜帶6種耐藥基因。大環內酯類耐藥相關的核糖體甲基化酶基因erm主要分為A、B、C、X型，本研究分離菌株為X型，多見于雙歧桿菌和棒桿菌屬；X型主要作用機制是使大環內酯類、林可酰胺類藥物作用的核糖體蛋白甲基化，菌株表現出對紅霉素、克林霉素耐藥[11-12]，本研究的藥物敏感性分析結果與其相符。氟喹諾酮類耐藥基因gyrA、gyrB的耐藥決定區出現突變，編碼蛋白與喹諾酮藥物結合能力下降，是菌株對喹諾酮耐藥的主要原因[13]。本研究分離菌株對左氧氟沙星中介，其耐藥機制還有待于進一步探究。此外，本研究還檢測出β-內酰胺類耐藥基因TEM、利福平耐藥基因rpoB和rbpA、氨基糖苷類耐藥基因TlyA，但均未表現出相應藥物的耐藥性，這可能與相應的基因未被激活，不能產生相關活性蛋白有關[12，14-15]。本研究分離菌株對復方磺胺甲噁唑和磷霉素表現為耐藥，但未檢測到相關耐藥基因，可能存點突變或膜通透性[2]改變等其他未檢出的耐藥機制。本研究分離菌株攜帶鏈霉素耐藥基因rpsL和gidB，但缺乏相關判讀標準，無法判斷其藥物敏感性[16-17]。臨床耐藥情況與耐藥基因檢測結果不完全相符的原因可能為：（1）本研究藥物敏感性分析為體外試驗，與臨床實際可能存在一定差異；（2）棒狀桿菌屬藥物敏感性判斷標準目前仍不完善，很多抗菌藥物仍無判讀標準，本研究中部分抗菌藥物參考了其他菌屬的判讀標準，結果可能存在一定的偏差。

本研究全基因組測序檢出6種毒力因子，包括DtxR、RelA、TcrX、PhoP、SpaE、SpaF。DtxR是鐵離子依賴的毒素調節蛋白，通過參與細菌的鐵離子負向調控轉運來保護細菌，避免其氧化受損[18]。RelA作為核糖體蛋白，可以催化合成（p）ppGpp，抑制RNA的合成，誘導其降解途徑，并參與調節DNA復制的基因表達[19]。TcrX與TcrY為雙組分系統，TcrY通過四股螺旋束形成二聚體，自身發生磷酸化將磷酸基傳遞給TcrX，兩者間的相互作用可能與某種信號的傳遞相關[20-21]。PhoP和PhoQ同樣為雙組分系統，由感應蛋白PhoP和反應調控蛋白PhoQ共同組成，菌體借此感知外界微環境中H+、抗菌肽、Mg2+的變化，直接或間接協調數百個毒力基因的表達，以抵御宿主免疫系統的捕殺，與致病力密切相關[22]。本研究2種雙組分結構均只檢出單一結構，可能與檢測方法的局限性有關。SpaE和SpaF均為SpaD型菌毛小亞單位組分，屬于菌體表面菌毛結構，菌體借此黏附錨定于細胞壁表面，使菌體與宿主緊密結合，從而產生致病力[23]。相關毒力因子共同作用，使結核硬脂酸棒狀桿菌侵入人體，導致感染。

綜上所述，結核硬脂酸棒狀桿菌引起的肉芽腫性乳腺炎在我國罕見，可能與該菌具有親脂性，表現為在普通血平板生長緩慢、血培養瓶中不能生長的生物學特性，以及鑒定方法的限制有一定的關系。本研究從分子水平初步分析了該菌的耐藥基因和毒力因子攜帶情況，并分析了其與表型的吻合度，可為該菌引起的感染性疾病的診治提供參考。建議臨床微生物實驗室對此類罕見致病菌多加關注，根據其生物學特性，選擇合適的培養方式和鑒定方法，以提高檢出率。