臨床血液和尿液樣本分離腸球菌毒力基因分析

康 怡， 朱 宏， 沈 瀚， 周萬青

（1.南京醫科大學鼓樓臨床醫學院，江蘇 南京 210008；2.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院檢驗科，江蘇 南京 210008）

腸球菌是人體胃腸道內自然定植的條件致病菌，在機體免疫功能受損和菌群移位時可引起泌尿道感染、血流感染、心內膜炎、腹膜炎等，是臨床感染病原菌中僅次于金黃色葡萄球菌的革蘭陽性球菌[1]。我國耐藥監測數據顯示，臨床分離腸球菌以屎腸球菌（48.0%）和糞腸球菌（44.8%）為主[1]；樣本來源以尿液樣本最多，其次為血液樣本，尿液樣本分離腸球菌以糞腸球菌為主，血液樣本中屎腸球菌更為常見[2]。雖然腸球菌感染的發病機制尚不明確，但有研究發現，全身性感染與移動遺傳元件編碼的某些毒力因子和抗菌藥物耐藥性具有一定的相關性[3]。毒力基因能幫助腸球菌突破宿主的免疫防御系統，造成定植，甚至侵入細胞，導致感染的發生和發展[1]。本研究旨在探討臨床血液樣本和尿液樣本中分離的腸球菌中6種毒力基因（cylA、agg、asa1、gelE、esp和hyl）的攜帶情況，為深入研究腸球菌毒力基因與致病性間的關系提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2017—2019年南京醫科大學鼓樓臨床醫學院臨床送檢中段尿樣本和血液樣本中分離的非重復腸球菌株196株，其中中段尿樣本來源106株（糞腸球菌49株、屎腸球菌57株）、血液樣本來源90株（糞腸球菌44株、屎腸球菌46株）。采用VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀（法國生物梅里埃公司）進行菌種鑒定，并經VITEK MS微生物質譜鑒定系統（法國生物梅里埃公司）復核。質控菌株糞腸球菌（ATCC 29212）為醫院微生物室留存菌株。

1.2 主要儀器和試劑

PCR擴增儀（美國ABI公司）；2×Taq Mix和4S GelRed核酸染料（上海BBI公司）；100 bp DNA Marker（日本TaKaRa公司）；蛋白酶K（美國Merck公司）；瓊脂糖干粉（法國Biowest公司）；164-5070通用凝膠電泳儀和GelDoc XR型凝膠成像分析系統（美國Bio-Rod公司）。

1.3 毒力基因擴增

采用加熱煮沸法提取細菌DNA，挑取純培養菌落，置于含200 ng/mL蛋白酶K溶液的1.5 mL離心管內，56 ℃水浴2 h后，再95 ℃水浴10 min，13 000×g離心30 s，取上清液為模板。采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增毒力基因cylA、esp、asa1、hyl、gelE和agg，參照文獻[4-5]合成引物。cylA、esp、asa1、hyl和gelE采取多重擴增方法，反應體系為50 μL，包括2×Taq Mix 25 μL，DNA模板2 μL，cylA、esp、asa1、hyl和gelE的上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，dd H2O 13 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 7 min。agg的反應體系為20 μL，包括2×Taq Mix 10 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，dd H2O 6 μL。PCR反應條件：94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 7 min。PCR產物經12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，GelRed染色后觀察結果。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計數資料以例或率表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糞腸球菌和屎腸球菌毒力基因攜帶情況

93株糞腸球菌攜帶asa1（76.3%）、gelE（71.0%）、cylA（64.5%）、esp（60.2%）和agg（22.6%）基因，未檢出hyl基因。103株屎腸球菌攜帶esp（68.9%）和hyl（31.1%）基因，未檢出cylA、asa1、gelE和agg基因。

2.2 不同樣本來源糞腸球菌毒力基因攜帶情況

血液樣本分離糞腸球菌以gelE基因檢出率（75.0%）最高；有13株僅攜帶gelE基因（10/13）；8株攜帶2種毒力基因，最常見組合是asa1-gelE（4/8）；21株攜帶多種（>2種）毒力基因，最常見的組合是cylA-esp-asa1-gelE-agg（8株）；2株6種毒力基因均未檢出。尿液樣本分離糞腸球菌以asa1基因檢出率（85.7%）最高；有4株僅攜帶gelE基因；5株攜帶2種毒力基因，常見的組合是esp-gelE（2株）和cylA-asa1（2株）；39株攜帶多種（>2種）毒力基因，最常見的組合是cylA-esp-asa1-gelE（16株）；1株6種毒力基因均未檢出。尿液樣本分離糞腸球菌cylA和asa1毒力基因檢出率高于血液樣本（P<0.05）。糞腸球菌毒力基因主要以組合形式存在。見圖1、表1、表2。

表1 不同樣本來源糞腸球菌毒力基因檢出情況 株（%）

表2 不同樣本來源糞腸球菌毒力基因檢出模式 株

圖1 腸球菌部分毒力基因PCR產物電泳圖

2.3 不同樣本來源屎腸球菌毒力基因攜帶情況

血液樣本分離的屎腸球菌僅檢出h y l（34.8%）和esp（58.7%）2種毒力基因；有18株僅攜帶esp基因，7株僅攜帶hyl基因，9株同時攜帶hyl和esp基因，12株未檢出毒力基因。尿液樣本分離的屎腸球菌也僅檢出hyl（28.1%）和esp（77.2%）2種毒力基因；有33株僅攜帶esp基因，5株僅攜帶hyl基因，11株同時攜帶hyl和esp基因，8株未檢出毒力基因。尿液樣本分離屎腸球菌esp毒力基因檢出率高于血液樣本（P<0.05）。屎腸球菌毒力基因主要以單基因形式存在。103株屎腸球菌中，僅20株同時檢出2種基因。見表3、表4。

表3 不同樣本來源屎腸球菌毒力基因檢出情況 株（%）

表4 不同樣本來源屎腸球菌毒力基因攜帶模式 株

2.4 相同樣本來源不同菌種毒力基因攜帶情況

血液樣本分離株中，糞腸球菌cylA、asa1、gelE和agg毒力基因的攜帶率高于屎腸球菌（χ2值分別為25.2、44.7、54.5、13.1，P<0.05）；屎腸球菌hyl毒力基因的攜帶率高于糞腸球菌（χ2=18.6，P<0.05），esp基因攜帶率差異無統計學意義（P>0.05）。尿液樣本分離株中，糞腸球菌cylA、asa1、gelE和agg毒力基因的攜帶率高于屎腸球菌（χ2值分別為77.8、80.9、55.7、12.8，P<0.05）；屎腸球菌hyl毒力基因的攜帶率高于糞腸球菌（χ2=16.2，P<0.05），esp基因攜帶率差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

本研究結果顯示，尿液樣本和血液樣本中，糞腸球菌均主要攜帶cylA、esp、asal、gelE和agg 5種毒力基因，而屎腸球菌均僅攜帶esp和hyl 2種毒力基因；糞腸球菌攜帶的毒力基因種類和各基因檢出率均高于屎腸球菌，提示糞腸球菌的毒力更強，與相關研究結果[6]一致。有研究結果顯示，萬古霉素耐藥屎腸球菌較萬古霉素敏感屎腸球菌攜帶的毒力基因種類更多[7]，會給臨床抗感染治療帶來更大的困難。esp基因編碼表面蛋白，可促進細菌進入細胞。有研究發現，臨床感染患者分離株esp基因的檢出率遠高于健康人腸道來源菌株[3]。提示esp基因與腸球菌臨床感染密切相關。本研究結果顯示，esp基因在糞腸球菌和屎腸球菌中均有檢出，且該基因在不同菌種間的表達差異無統計學意義（P>0.05），提示esp基因可能是腸球菌感染機體的重要條件之一。hyl基因作為屎腸球菌特有的毒力基因[8-9]，基因序列與釀膿鏈球菌透明質酸酶基因高度同源[3]，所表達的蛋白可促進細菌在組織細胞中的擴散，進而促進細菌侵襲的發生。有研究發現，用含有hyl質粒的屎腸球菌轉染小鼠腹膜炎模型，可使其定植率更高，毒力和耐藥性更強[10-11]。

王彥杰等[12]發現，不同樣本分離糞腸球菌或屎腸球菌在毒力基因的攜帶種類上具有一致性，但尿液樣本分離菌株部分毒力基因攜帶率高于血液樣本分離菌株：尿液樣本分離糞腸球菌cylA和asa1攜帶率高于血液樣本（P<0.05），屎腸球菌esp攜帶率高于血液樣本（P<0.05），與本研究結果相似。提示致尿路感染的腸球菌攜帶多種毒力基因。不同樣本來源菌株毒力基因表達差異的可能原因有：（1）與患者狀態有關，腸球菌血流感染好發于免疫功能嚴重受損的患者，此類患者常合并惡性腫瘤、心血管疾病、胃腸道疾病等[13]，病死率高；腸球菌尿路感染多發生于尿路結構異常和接受尿路侵入性操作的患者[14]；（2）與細菌生存環境有關，本研究結果顯示，cylA和asa1基因在尿液樣本分離菌株中的檢出率顯著高于血液樣本分離菌株，這種在某個環境中出現頻率顯著增高的毒力基因被稱為環境特異性毒力基因[12]，多種環境特異性毒力基因的協同作用可能是腸球菌尿路感染的致病機制之一；（3）與生物膜形成能力有關，本研究結果顯示，尿液樣本分離腸球菌較血液樣本分離菌株毒力基因種類更多；有研究發現，致尿路感染菌株較致血流感染菌株更易形成生物膜[15]。本研究發現，不同部位分離同種菌株攜帶毒力基因的組合模式不同，尿液樣本分離糞腸球菌以cylA-esp-asa1-gelE和cylA-esp-asa1組合較常見，而血液樣本分離糞腸球菌卻以單獨攜帶gelE基因最常見。提示同種易感病原菌在不同的生理部位存在毒力差異，這種差異可能影響抗菌藥物的治療效果。

綜上所述，相同樣本來源糞腸球菌較屎腸球菌攜帶毒力基因種類更多，檢出率更高；相同菌種尿液樣本分離株較血液樣本分離株毒力基因攜帶率更高。毒力基因的差異可能導致菌株致病能力和對環境的適應性不同。按菌種和樣本來源進行毒力基因分析，可為單一感染部位分離菌株致病機制研究提供參考。