血小板最大聚集率和血栓最大振幅在兒童血小板無力癥和巨大血小板綜合征中的臨床應用

苗文佳， 谷 昊， 李 剛

（國家兒童醫學中心 首都醫科大學附屬北京兒童醫院 北京市兒科研究所血液疾病研究室，北京 100045）

出血性疾病是止血功能障礙引起自發或輕微外傷后出血不止或反復出血的一組疾病，兒童期較為常見，約占兒科血液病的30%[1]。血小板功能異常所致先天性出血性疾病較為罕見，臨床上主要分為血小板無力癥（Glanzmann thrombasthenia，GT）、巨大血小板綜合征（Bernard-Soulier syndrome，BSS）、貯存池病。光學比濁法（light transmittance aggregometry，LTA）是血小板功能檢測的金標準[2]，主要通過各種生理性致聚劑誘導血小板聚集來檢測血小板最大聚集率（maximum aggregation rate，MAR）。血栓彈力圖（thromboelastography，TEG）是一種新型的床旁檢測血液黏彈性的方法，可綜合評價全血凝溶狀態，其參數血栓最大振幅（maximum amplitude，MA）可用來評價血小板聚集功能。目前，關于通過MAR、MA來鑒別GT和BSS的研究較少。本研究通過比較不同致聚劑誘導的MAR和MA值在GT和BSS中的差異，分析2項指標在伴血小板功能障礙的先天性出血性疾病中的診斷價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2014年7月—2021年6月首都醫科大學附屬北京兒童醫院血液腫瘤中心確診為先天性出血性疾病的患兒57例，其中男36例、女21例，年齡5.5（2.3～8.1）歲，包括GT患兒24例（GT組）、BSS患兒13例（BSS組）和凝血因子缺乏癥患兒20例（對照組）。3個組性別、年齡差異均無統計學意義（P>0.05）。以二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導的MAR<55%和MA值<52 mm作為陽性判斷標準[3-4]。本研究經首都醫科大學附屬北京兒童醫院醫學倫理委員會審批通過，審批號為[2021]-E-244-R。

1.2 主要儀器與試劑

美國Helena公司AggRAM血小板聚集儀和配套誘導劑[5 μmol/L ADP、2.5 μg/mL膠原蛋白（collagen，Col）、500 μg/mL花生四烯酸（arachidonic acid，AA）、1.5 mg/mL瑞斯托霉素（Ristocetin，Risto）]。美國Haemoscope公司TEG5000血栓彈力圖儀和配套分析軟件 。

1.3 樣本采集和處理

采集所有患兒空腹靜脈血4 mL，枸櫞酸鈉抗凝，用于血小板聚集試驗。先將血液樣本200×g離心10 min，分離富血小板血漿；再1 500×g離心15 min，提取乏血小板血漿。用乏血小板血漿調整富血小板血漿中的血小板數量至（200～250）×109/L待測[5]。采用全血樣本直接上機分析TEG。所有血液樣本確保表觀無溶血、乳糜、黃疸。

1.4 方法

將AggRAM血小板聚集儀預熱20 min，至恒溫（37 ℃）后進行光路定標。將乏血小板血漿作為空白對照，測定透光度；在富血小板血漿中加入小磁珠和致聚劑，待血小板聚集濁度出現變化，形成血小板聚集曲線5 min后，記錄MAR。將20 μL氯化鈣加入測試杯，再將用340 μL高嶺土激活的血液樣本緩緩加入測試杯中，記錄MA值，2 h內完成檢測。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件和GraphPadPrism 7.0軟件進行統計分析。非正態分布的計量數據以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間配對比較采用非參數Wilcoxon符號秩檢驗。采用Spearman相關分析評價MAR與MA值的相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血小板聚集功能比較

GT組ADP、Col、AA誘導的MAR和MA值均低于對照組和BSS組（P<0.01），Risto誘導的MAR低于對照組（P<0.01）。BSS組Risto誘導的MAR低于對照組和GT組（P<0.01），AA誘導的MAR與對照組差異無統計學意義（P=0.05）。見表1、圖1。

圖1 各組血小板聚集功能結果比較

表1 各組血小板聚集功能比較

2.2 各組不同致聚劑誘導的MAR與MA值相關性分析

各組不同致聚劑誘導的MAR與MA值均無相關性（P>0.05）。見表2。

表2 各組4種致聚劑誘導的MAR與MA值的相關性分析

3 討論

GT和BSS均為兒童常染色體隱性遺傳的先天性出血性疾病，臨床上BSS較GT更為罕見，發病率不足1/100萬[6]。血小板聚集試驗是診斷GT和BSS重要的實驗室檢測項目。不同種類、濃度致聚劑體外誘導原理在不同疾病中存在差異，本研究選用4種致聚劑進行血小板聚集試驗：Risto介導血小板膜糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅰb受體與血管性血友病因子相互作用；AA經環氧化酶作用轉變為血栓烷A2；Col需預先誘導血小板釋放ADP，ADP通過作用人體細胞膜表面特異性受體來激活磷脂酶C，促進體內鈣離子的釋放，引發第一時相血小板聚集。采用TEG參數MA值評價纖維蛋白原和血小板通過GPⅡb/Ⅲa受體結合后血凝塊最大強度和穩定性，可間接反映血小板聚集功能。

GT和BSS均為血小板的膜糖蛋白缺陷，但機制不盡相同。GT為GPⅡb/Ⅲa基因突變導致的蛋白復合物合成、轉運、表達和功能障礙，可使除Risto外的生理性致聚劑誘導的血小板聚集水平大大減低。本研究中，GT組Risto誘導的MAR處于參考區間（55%～90%）內，其他3種致聚劑誘導的MAR均顯著降低，與相關研究結果[7]一致。李健等[8]提出，MA值聯合血小板聚集試驗和流式血小板功能分析可鑒別診斷GT，與本研究GT組MA值低于對照組和BSS組的結果基本相符。BSS是由GPⅠb/Ⅴ/Ⅸ復合物基因缺陷導致的，患者血小板不能黏附于受損血管壁。有研究發現，BSS患兒血小板體積巨大、數量少，反應體系濁度變化不能完全反映血小板聚集水平[9]，與本研究結果不一致。對于血小板數量不足的樣本，本研究采取增加采血量、降低離心力和僅收集富血小板血漿上層血漿等方法來保證反應體系血小板數量滿足需求，減少因血小板數量不足所致的結果偏差。

本研究中，BSS組MA值基本處于參考區間（52～70 mm）內，提示MA值評價血小板黏附功能欠佳，與ADLER等[10]MA值無法監測血小板和內皮細胞導致的凝血功能障礙的研究結果一致。本研究結果顯示，BSS組與對照組AA誘導的MAR差異無統計學意義（P=0.05），后續將增大樣本量持續觀察，以確認這一差異。有研究結果顯示，GT患者Risto誘導的MAR為正常或臨界正常[11-12]，GT患者與對照者Risto誘導的MAR差異無統計學意義。本研究中，2個組雖有差異，但結果均在廠家提供的參考區間內。考慮到兒童與成人MAR參考區間不同，建議各臨床實驗室建立本實驗室相關項目的參考區間，以有效體現其臨床價值。

有研究結果顯示，MAR與MA評價血小板聚集功能存在較好的相關性[13]，但本研究發現，4種致聚劑誘導的MAR與MA值在各組中均不存在線性關系。MAR和MA值均受血小板和纖維蛋白原共同作用，原因可能是2種方法的檢測原理和干擾因素不同，MAR反應體系為富血小板血漿，加入致聚劑激活血小板后，GPⅡb/Ⅲa復合物暴露出纖維蛋白原受體，并與其結合，使血小板聚集，利用透光度差異計算血小板聚集率，反應過程中白細胞和紅細胞已被基本去除，無法監測到生理狀態下血小板與各細胞間的相互作用，如血管壁受損時血小板的黏附狀態[14]。LTA檢測光路僅能識別5個及以上血小板聚集后的較大聚集物，對于體積較小的聚集物濁度變化不易記錄。紅細胞混雜、標本量和血小板數量減少等分析前因素均可導致懸液透光度發生變化，對MAR檢測結果產生影響。另外，MA值檢測體系為全血，借助高敏感懸垂絲動態描繪整個凝血過程中血凝塊的黏彈力變化，有效分析全血凝溶過程，與MAR比較，對小顆粒更為敏感[2，15]。LTA檢測過程中同樣存在諸多干擾因素，全血樣本直接上機無法觀察溶血、乳糜等外觀狀態，如果樣本溶血、磷脂暴露、紅細胞和血小板數量異常增多，均可影響MA值檢測結果的準確性[16-17]。

綜上所述，MAR和MA值在檢測血小板功能障礙方面各有優勢和局限性。MAR在診斷和鑒別GT和BSS方面更有優勢，MA診斷BSS則準確性欠佳。多個致聚劑聯合檢測MAR可更好地反映先天性出血性疾病患兒的血小板功能。作為一項回顧性研究，本研究樣本量較小，尚需更多數據來驗證MAR和MA值評價血小板功能障礙的有效性和臨床價值。