龜茸壯骨片質量標準提升研究

高英鑫，徐 偉，張衍旭，王野諶，張 雷，祝雨婕，董雪蓮*

(1.長春中醫藥大學，吉林 長春130117；2.吉林省中研藥業有限公司，吉林 長春130062)

龜茸壯骨片(WS-5947-(B-0947)-2002)是吉林省中研藥業有限公司研發生產的省級獨家品種，由鹿茸、龜甲(醋制)、骨碎補、補骨脂、續斷5味中藥組成，具有溫陽補腎、益髓壯骨的作用[1-3]，在臨床上常用于治療中老年人筋骨痿軟的輔助用藥。按照原國家食品藥品監督管理局相關標準，目前龜茸壯骨片中以補骨脂素為對照通過薄層掃描法進行含量測定，以柚皮苷為對照通過薄層鑒別作為質量控制。上述質量控制標準過于簡單，難以全面反映和控制龜茸壯骨片的質量。中藥復方制劑是由多種有效成分組成，經多靶點、多途徑發揮功效，且各味藥間經整合而實現其有利于機體的特定終末效應[4]，多指標成分測定已成為質量評價的主要發展趨勢[5]。龜茸壯骨片中骨碎補具有療傷止痛、補腎強骨的作用[6-7]，主要成分柚皮苷是一種黃酮單體物質，具有抗炎和抗氧化作用[8]，可在促進骨形成的同時，抑制骨破壞[9-10]。補骨脂具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉的功效[11]，其主要成分補骨脂素和異補骨脂素是兩種呋喃香豆素類化合物[12]，可促進成骨細胞增殖和分化成熟，并抑制其凋亡[13-14]。此兩味藥組成臨床治療骨質疏松的常用聯合藥對，二者強強聯合，可從多角度對骨損傷進行修補。本研究在現行質量標準的基礎上，參考相關文獻所用方法[14]，以多指標成分測定入手，建立續斷和補骨脂的薄層鑒別方法和骨碎補、補骨脂中柚皮苷、補骨脂素、異補骨脂素含量測定的高效液相色譜法，旨在為龜茸壯骨片質量標準提高和改進提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超聲波提取器(功率 250 W、頻率 50 kHz，型號為KH-250B)；高效液相色譜儀(型號為1260，配備DAD紫外檢測器)；電子分析天平[十萬分之一(MS105DU型)與萬分之一(EL204型)]。

1.2 藥品與試劑

續斷對照藥材(購買于上海源葉生物科技有限公司)，薄層板(G，10 cm×10 cm)，川續斷皂苷、柚皮苷、補骨脂素、異補骨脂素標準品均購自中國食品藥品檢定研究院；龜茸壯骨片(20201101、20201102、20201103、20201104、20201105)及陰性樣品均由吉林省中研藥業有限公司提供；甲醇為分析純；乙酸和甲醇均為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 續斷薄層鑒別

取龜茸壯骨片5片，除去糖衣，研細待用。取1 g粉末按2020版《中國藥典》“續斷”項下薄層方法進行鑒別。將薄層板置于烤板機加熱后，可觀察到有斑點顯現。在供試品色譜中，在與對照品及對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。且陰性無干擾，具有良好的專屬性，表明所用方法可用于龜茸壯骨片中續斷的鑒別。見圖1。

圖1 龜茸壯骨片中續斷薄層鑒別

2.2 補骨脂薄層鑒別

取龜茸壯骨片5片，除去糖衣，研細待用。取粉末2 g按2020版《中國藥典》“續斷”項下薄層方法進行鑒別。將展開劑比例調節為正丁烷-乙酸乙酯(2∶1)，噴以顯色劑后可觀察到在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。且陰性沒有出現干擾，具有良好的專屬性，表明所用方法可用于龜茸壯骨片中補骨脂的鑒別。見圖2。

圖2 龜茸壯骨片中補骨脂薄層鑒別

2.3 補骨脂素、異補骨脂素、柚皮苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ZXRBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.05%乙酸溶液-甲醇(65∶35)等度洗脫；柱溫：25 ℃；檢測波長：246 nm(用于檢測補骨脂素及異補骨脂素)、284 nm(用于檢測柚皮苷)；流速：1.0 mL/min；進樣量：5 μL[12]。

2.3.2 溶液的制備 (1)對照品溶液的制備。精密稱取各對照品制成每1 mL混合對照品含柚皮苷0.055 9 mg、補骨脂素0.018 1 mg、異補骨脂素0.016 2 mg的混合溶液。

(2)供試品溶液的制備。取龜茸壯骨片粉末2.5 g，加適量甲醇加熱回流提取3 h，放至室溫，轉移至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻后濾過即得。

(3)陰性供試品溶液的制備。取缺骨碎補、缺補骨脂的陰性樣品，按與供試品相同的方法制備即得。

2.3.3 方法學驗證 (1)專屬性試驗。對混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液進樣，記錄色譜圖。觀察發現，供試品色譜中，在與對照品溶液色譜相應的保留時間處均有相對應的色譜峰，分離度良好，無雜質峰干擾，陰性樣品無干擾。見圖3。

注：A.混合對照品；B.供試品溶液；C.補骨脂陰性對照；D.骨碎補陰性對照；E.空白溶液。1.柚皮苷；2.補骨脂素；3.異補骨脂素。

(2)線性關系考察。精密稱取柚皮苷對照品加甲醇制成濃度分別為0.465 836、0.372 669、0.186 334、0.093 167、0.046 584、0.023 292 mg/mL的溶液。補骨脂素對照品液加甲醇制成濃度分別為0.108 123、0.058 976、0.032 437、0.016 219、0.009 829、0.004 915 mg/mL的溶液。異補骨脂素對照品加甲醇制備成濃度分別為0.101 189、0.050 595、0.025 297、0.020 238、0.010 119、0.005 059 mg/mL的溶液。按“2.3.1”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標，質量濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線。經線性關系考察發現，所制標準曲線線性關系良好，見表1。

表1 線性關系考察結果

(3)耐用性試驗。取同一份供試品溶液，分別在不同條件下，按照不同色譜條件進樣測定，計算柚皮苷、補骨脂素、異補骨脂素含量RSD。結果表明，所用方法耐用性良好，見表2。

表2 各成分耐用性試驗結果 (mg/g)

(4)穩定性試驗。精密吸取同一供試品溶液及混合對照品溶液各5 μL，分別于配制后的 0、1、2、4、6、8、10、12、14、24 h 按“2.3.1”項下色譜條件進行測定(表3)。觀察發現，龜茸壯骨片供試品溶液及對照品溶液中的柚皮苷、補骨脂素、異補骨脂素3個待測成分在室溫下放置 24 h 內穩定性良好。

表3 各成分24 h穩定性試驗結果 (%)

(5)重復性試驗。精密稱取龜茸壯骨片樣品(批號20201103)2.5 g，平行制備6份供試品測定含量。結果表明，所用方法重復性較好,見表4。

表4 重復性試驗結果

(6)加樣回收率試驗。精密稱定已知含量的龜茸壯骨片樣品(批號20201103)6份，每份1.25 g 。分別加入與樣品中待測成分含有量相當的對照品后進行測定，記錄峰面積，計算回收率。結果表明，所用方法回收率符合要求，見表5。

表5 加樣回收率試驗結果 (n=6)

(7)精密度試驗。精密吸取混合對照品溶液5 μL，連續進樣6次，測定，記錄峰面積，計算RSD。結果柚皮苷峰面積的RSD(n=6)為0.19%；補骨脂素峰面積的RSD(n=6)為0.26%；異補骨脂素峰面積的RSD(n=6)為0.35%。表明所用方法與本儀器的精密度良好。

2.3.8 樣品含量測定 取5批不同批次龜茸壯骨片制備供試品溶液，并進行含量測定，記錄色譜圖，結果見表6。

表6 樣品的含量測定結果 (mg·g-1)

3 討論

本實驗對龜茸壯骨片部分標準進行了修訂與提高研究，對原標準中未列入的薄層色譜鑒別項的藥材進行了薄層色譜研究，在龜甲與鹿茸的薄層鑒別中，因其為動物藥成分較為復雜且不易被提取導致薄層鑒別不穩定且很難重現，故決定不將二者薄層方法納入質量提升標準之中。續斷的薄層色譜重現性、專屬性好，陰性無干擾，故可列入質量標準正文。在補骨脂的薄層方法研究中，改良了藥典中展開劑的比例，以保證所測物質的斑點分離得更好且處于薄層板中央易于觀察。在含量測定方法的探索中，選擇HPLC法以雙波長同時測定三種成分，可以更快更好地對質量進行一定控制。在探索階段前期，利用DAD檢測器的全波長特點進行考量，最終選出最大吸收波長。并依次對柱溫、提取方式、提取方法進行考量，對流動相的比例、進樣量對峰型及分離度進行考察，最終確定穩定可靠、簡潔便利的質量控制方法，并納入標準正文。本研究成果可用于龜茸壯骨片的質量控制，可為保障其臨床用藥的安全性和有效性提供保障。