番茄立枯病生防菌株B11-64 的鑒定及其生防特性

舒芳玲，李鳳芳，黎起秦，袁高慶，林 緯

（1. 廣西大學農(nóng)學院，廣西 南寧 530004；2. 廣西大學農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，廣西 南寧 530004）

番茄是我國廣泛種植的蔬菜之一，深受人們的喜愛。番茄在生長過程中會受到立枯病、灰霉病、潰瘍病和青枯病等多種病害的危害，其中以立枯病發(fā)生較為普遍。該病由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起，不僅在苗床期可引起成片死苗現(xiàn)象，還可以在大田期造成莖基腐病，嚴重影響番茄的產(chǎn)量和品質[1]。立枯絲核菌的寄主范圍非常廣，至少可侵染43 科260 多種植物，包括禾本科（水稻、小麥、玉米等）、茄科（番茄、馬鈴薯、煙草等）、豆科（花生、大豆、紫花苜蓿等）等，是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一種重要病原菌[2-3]。目前，主要通過化學藥劑和加強苗期栽培管理等方式防治番茄立枯病。但是長期使用化學藥劑一方面會使病原菌產(chǎn)生抗藥性而加大防治難度，另一方面會因為增加用藥劑量和次數(shù)而導致農(nóng)業(yè)面源污染；而加強栽培管理一方面會因操作人員的水平問題而難以全面實施到位；另一方面該方式只能起預防作用，一旦疾病暴發(fā)，其防治效果幾乎沒有。而生物防治是利用生物物種間的相互關系，以一種或一類生物抑制另一種或另一類生物的防治手段。它最大的優(yōu)點是不會對環(huán)境產(chǎn)生污染，也不存在抗藥性等問題，具有農(nóng)藥等非生物防治方法所不能比的優(yōu)點[4]。

目前，用于防治番茄立枯病的生防菌主要有芽孢桿菌、木霉以及放線菌。Asaka 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，使用枯草芽孢桿菌RB14-C 防治番茄立枯病能使病株率下降68.5%，同時還能顯著增加番茄的莖干重和莖長。李紀順等[6]研究表明，芽孢桿菌SH6-1 對番茄立枯病的防治效果能達到61.7%，且能增加番茄株高和鮮重；陳凱等[7]研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉重組株L-15菌懸液的10 倍和100 倍稀釋液對番茄立枯病的溫室防治效果分別達89.27%和86.25%；王艷等[8]研究表明，內生放線菌SR-1102 對番茄立枯病的防治效果為6.67%～80.08%。但目前中國農(nóng)藥信息網(wǎng) 中登記的用于防治立枯絲核菌引發(fā)病害的生防菌制劑僅有芽孢桿菌、哈茨木霉等種類，產(chǎn)品相對單一，有待加大研發(fā)力度，更好地滿足生產(chǎn)需要。

筆者所在課題組前期從蔬菜土壤中篩選到一株對立枯絲核菌防效較好的生防細菌菌株B11-64，其對番茄立枯病的盆栽防效達到86.11%，大田防效為41.47%，表現(xiàn)出較好的生防效果。為了進一步明確該菌株的生物防治潛力，研究對該菌株進行鑒定，測定其生防相關特性，初步分析該菌株對立枯絲核菌的抑菌機制，以期為該菌株生防制劑的研發(fā)以及番茄立枯病的生物防治提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病原菌和生防菌株番茄立枯病菌R003

菌株為立枯絲核菌，分離自番茄立枯病病株莖基部，通過致病性測定，為強致病力菌株。抑菌譜中供試的植物病原菌有：苦瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、香蕉煤紋病菌（Deightoniella torulosa）、煙草莖點霉葉斑病菌（Phoma sorghina）、柑橘沙皮病菌（Diaporthe citri）、煙草猝倒病菌（Pythium aphanidermatum）、蘋婆炭疽病菌（Colletotrichum siamense）和姜白絹病菌（Sclerotium rolfsii）。試驗生防菌株為課題組前期篩選的生防細菌菌株B11-64，自主保存。對照生防菌為：巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）B196 菌株、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）2P24 菌株和Pf-5 菌株，均由廣西大學農(nóng)學院提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基和檢測液（1）基礎培養(yǎng)基：氯化鈉1.0 g，磷酸氫二鉀1.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.2 g，去離子水990 mL；測定碳源時，在基礎培養(yǎng)基中加入1% 0.1 g/mL 的硝酸銨溶液；測定氮源時，在基礎培養(yǎng)基中加入1% 0.1 g/mL 的葡萄糖溶液。（2）PPM 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，硝酸鉀1 g，甘油20 mL，pH 值7.2，去離子水1 000 mL。（3）King's B 培養(yǎng)基：甘油10 mL，蛋白胨20 g，七水硫酸鎂1.5 g，磷酸氫二鉀1.5 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。（4）MSA 培養(yǎng)基：蔗糖20 g，天冬酰胺2 g，磷酸氫二鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。（5）NA 培養(yǎng)基：酵母粉3 g，蛋白胨5 g，蔗糖10 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。（6）NB 培養(yǎng)液：蛋白胨6 g，蔗糖12 g，牛肉浸膏3 g，去離子水1 000 mL。（7）LB 培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。（8）PDA（Potato Dextrose Agar）培 養(yǎng) 基：46 g PDA 制劑粉（青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司），去離子水1 000 mL。（9）藍色檢測液的配制：溶液1，將0.07 g 鉻天青（CAS）粉末溶于50 mL 去離子水中，再加入10 mL 1 mmol/L 的氯化鐵溶液（含有10 mmol/L 鹽酸）；溶液2：將0.06 g 的十六烷基三甲基溴化銨（HDTMA）溶于40 mL 去離子水中；溶液3：將溶液1 沿三角瓶壁緩緩加入到溶液2 中，使得溶液1 與2 混合均勻，即CAS 藍色檢測液。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株B11-64 的鑒定用透射電鏡觀察菌體的形態(tài)，參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]，描述菌落特征，進行生理生化特征測定。另外，采用通用引物16s-63F 和16s-1387R[10]擴增生防菌株16S rRNA 基因序列。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將所得到的PCR 產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司純化并測序，在NCBI 中與GenBank 數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有序列進行Blast 序列同源性比較，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.2 菌株B11-64的抑菌譜測定采用平板對峙法[11]

測定菌株B11-64 的抑菌率。在PDA 平板中央接種直徑為9 mm 病原菌菌餅，在距離病原菌菌餅2 cm 的周圍對等4 處位置分別滴加B11-64 菌懸浮液5 μL，以僅接種靶標菌作為對照，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，待對照中的菌落剛好長滿整個培養(yǎng)皿時，測量對照組和處理組中病原菌菌落直徑，每處理3 次重復。抑菌率（%）=[（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）]×100。

1.2.3 菌株B11-64 的生防特性測定（1）菌株B11-64 對立枯絲核菌R003 菌株菌絲結構的影響。將R003菌餅接種于PDA 培養(yǎng)基平板中央，距離病原菌2 cm處劃線接種B11-64 菌液，于28℃下培養(yǎng)3 d，挑取抑菌帶邊緣的菌絲，在掃描電鏡下觀察菌絲形態(tài)，以PDA 培養(yǎng)基中生長的病菌菌絲作為對照。（2）B11-64 菌株的生物膜形成能力測定。將B11-64 菌株接種于NB 培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)12 h，取50 μL 菌液接種于含有500 μL LB 培養(yǎng)液的離心管中，以純LB 培養(yǎng)液為對照，28℃靜置培養(yǎng)12 h，倒去多余培養(yǎng)液，用滅菌水輕輕沖洗1 遍后，加入1 mL 的1%結晶紫染液染色15 min，倒掉染液，用無菌水沖洗一次。將待測管置于室溫下吹干，用1 mL 的95%乙醇洗脫紫環(huán)，在600 nm 處測定其吸光度值。以高產(chǎn)生物膜的熒光假單胞菌2P24 菌株為對照菌，每個處理3 次重復。（3）B11-64 菌株分泌嗜鐵素的檢測。將MSA 培養(yǎng)基融化并冷卻至55～60℃，以10%的比例沿三角瓶壁緩緩加入CAS 檢測液。倒置12 h 后，將B11-64接到MSA-CAS 平板上，以熒光假單胞菌Pf-5 菌株作為陽性對照，巨大芽孢桿菌B196 菌株作為陰性對照。每處理3 次重復，置于28℃條件下培養(yǎng)3 d，觀察菌落外圍黃色暈圈的大小。（4）B11-64 菌株分泌氫氰酸的檢測。將苦味酸試紙浸入2%碳酸鈉溶液中，迅速將試紙放入培養(yǎng)皿蓋內，將B11-64 接種到含4.4 g/L 的甘氨酸King's B 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿四周用封口膜封住。以不含菌平板作為空白對照，每處理3 次重復，置于28℃培養(yǎng)3 d。氫氰酸（HCN）與苦味酸在碳酸鈉存在下顏色發(fā)生變化，根據(jù)顏色判斷HCN 的產(chǎn)生。（5）B11-64 菌株分泌抗生素的檢測。首先，利用表1 中的引物PCA2a/PCA3b[12]、phl2a/phl2b[12]、pltcf/pltcr[13]和prnCF/prnCR[14]分 別 擴 增 吩嗪-1- 羧 酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA）、 吡咯菌素（pyrrolnitrin，PRN）、2,4-二乙酰基間苯三酚（2,4-diacetylphloroglucinol，2,4-DAPG）和藤黃綠膿菌素（pyoluteorin，PLT）合成基因簇對應的片段。以熒光假單胞菌Pf-5 菌株作為phzCD、prnC、pltC和和phlD基因的陽性對照，獲得的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。其次，采用薄層層析的方法檢測B11-64 菌株是否含有PRN 和PCA。PRN 的粗提取：將新鮮B11-64 接種到NA 平板上，置于28℃下培養(yǎng)7 d后，將培養(yǎng)基切成小塊后，轉移到三角瓶中，加入50 mL 乙酸乙酯，封好三角瓶口放在37℃下180 r/min振蕩90 min，離心收集上清，旋轉蒸發(fā)，用100 μL 99.5%甲醇溶解，獲得 PRN 粗提物，每處理3 次重復。PCA 的粗提取：取B11-64 單菌落移于King's B 培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，以2%的接種量接種到50 mL PPM 培養(yǎng)液中，28℃下150 r/min 振蕩培養(yǎng)4 d 后，以8 000 r/min 離心10 min，收集上清，用1 mol/mL 鹽酸酸化至pH 值為 2.0，用0.4 倍體積的乙酸乙酯萃取，振蕩10 min，收集乙酸乙酯層，旋轉蒸發(fā)，用100 μL 99.5%甲醇溶解，獲得PCA 粗提物，每處理3 次重復。再次，將PRN 和PCA 的粗提取物、PCA 標準品以及高產(chǎn)PRN 菌株Pf-5 的粗提物溶液用毛細管點在GF型薄層層析硅膠板的一端，置密閉槽中，展開劑為氯仿與丙酮混合物（V ∶V=19 ∶1），待展開劑展開至離TLC 板前端約1 cm 處時取出，晾干，將TLC 板置于紫外燈下，觀察斑點位置，每處理3 次重復。最后，測定PCA 粗體物對立枯絲核菌的抑制作用：取PCA粗提物5 μL，按照前述方法測定其對立枯絲核菌的抑制作用，分別以1×107CFU/mL 新鮮菌液、PCA 標準品和99.5%甲醇各5 μL 作對照，每處理設3 次重復。

表1 B11-64 菌株分泌抗生素檢測中所用引物

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010 軟件進行匯總，用DPS 7.05 軟件進行統(tǒng)計分析；方差分析平均數(shù)間的差異顯著性分析采用鄧肯氏新復極差檢驗法（DMRT）進行。

2 結果與分析

2.1 B11-64 菌株的鑒定

2.1.1 B11-64 菌株菌落和菌體形態(tài)特征在NA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后， B11-64 菌株可形成1 mm 左右圓形菌落，產(chǎn)生橙色色素，菌落表面光滑凸起，邊緣整齊。菌體大小為（0.7～0.8）μm×（1.5～3.6）μm，長橢圓形，單極生鞭毛。

2.1.2 生理生化特性B11-64 菌株革蘭氏染色陰性，反硝化反應、氧化酶反應、明膠水解反應、脂酶（Tween80）反應、精氨酸雙水解反應、葡萄糖利用和果糖利用均表現(xiàn)為陽性，膿青素生成、淀粉水解反應則表現(xiàn)為陰性。根據(jù)B11-64 菌株的形態(tài)和生理生化特性，參照前人鑒定方法[9]，初步鑒定其屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）。

2.1.3 分子生物學鑒定將B11-64 菌株的16S rRNA

基因序列雙向測序后，在NCBI 網(wǎng)站的GenBank 進行相似性比對分析，菌株B11-64 與綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）的親緣關系最近，同源性達到99%以上。基于B11-64 菌株與其親緣關系相近菌株的16S rRNA 基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。從圖1 可看出，該菌株與多個P.chlororaphis菌株聚在同一分支。因此，結合形態(tài)學及生理生化特征，將B11-64 菌株鑒定為綠針假單胞菌。

圖1 基于B11-64 菌株與其親緣關系相近菌株的16S rRNA 基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株B11-64 的抑菌譜

對B11-64 菌株的抑菌譜測定結果（表2）顯示，該菌株對供試7 種植物病原菌的生長都具較強的抑制作用，抑菌率超過57%；其中，對香蕉煤紋病菌和煙草猝倒病菌的抑菌作用最強，抑菌率大于80%。

表2 生防菌B11-64 對供試病原真菌的抑菌率

2.3 菌株B11-64 生防特狀分析

2.3.1 菌株B11-64 對立枯絲核菌菌絲結構的影響將B11-64 菌株與立枯絲核菌對峙培養(yǎng)3 d 后，立枯絲核菌菌絲溢縮（圖2），表明菌絲的結構受到破壞。

圖2 掃描電鏡下觀察B11-64 菌株對立枯絲核菌菌絲結構的影響

2.3.2 B11-64 菌株生物膜的形成在EP 管中培養(yǎng)B11-64 菌株48 h 后，在與空氣接觸面的管壁上形成清楚的紫色環(huán)痕，用95%乙醇將環(huán)痕洗脫下來后測得OD600nm的值為1.022，與對照菌株熒光假單胞菌2P24菌株的生物膜產(chǎn)生量（OD600=1.098）處于相同水平。

2.3.3 B11-64 菌株氫氰酸和嗜鐵素的產(chǎn)生氫氰酸（HCN）檢測濾紙出現(xiàn)黃色向紅棕顏色的變化，表明B11-64 有HCN 的產(chǎn)生。以假單胞菌Pf-5 菌株為陽性對照，芽孢桿菌B196 作為陰性對照，B11-64 和Pf-5菌株在CAS-MSA 平板上產(chǎn)生黃色暈圈，說明B11-64菌株產(chǎn)生嗜鐵素。

2.3.4 B11-64 菌株中抗生素合成相關基因的檢測PCR 擴增結果如圖3 所示，B11-64 菌株基因組可擴增得到phzCD基因與prnC基因片段，但不含pltC基因和phlD基因，而對照菌株Pf-5 可擴增到4 種抗生素的基因片斷，說明菌株B11-64 可能產(chǎn)生PRN 和PCA 這2 種抗生素。分別以PCA 純品和熒光假單胞菌Pf-5 產(chǎn)生的PRN 作為參照，對B11-64 菌株PCA和PRN 粗提物進行薄層層析，結果證實綠針假單胞菌B11-64 可分泌PCA，但未觀察到分泌PRN。通過平板抑菌試驗測定PCA 粗提物對立枯絲核菌的抑制作用的結果顯示，PCA 粗提物對病原菌有一定的抑制作用，但PCA 標準品對立枯絲核菌并無抑制作用（圖4），說明B11-64 菌株發(fā)酵粗提物中可能含有對立枯絲核菌具有抑制作用的其他代謝物質。

圖3 B11-64 菌株4 種抗生素合成基因的檢測

圖4 B11-64 菌株PCA 粗提物對立枯絲核菌的拮抗作用

3 結論與討論

近年來，隨著人類對生態(tài)環(huán)境的逐步重視以及農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展的需要，利用拮抗微生物防治土傳病害受到越來越多的關注。獲得高效廣譜的生防菌資源是實施生物防治的前提。課題組從番茄田塊土壤中篩選得到對番茄立枯病抑制活性較強的菌株B11-64，經(jīng)鑒定為綠針假單胞菌。綠針假單胞菌是2000 年由Yamamoto 等[15]從熒光假單胞菌中分出來的一個種，因其產(chǎn)生豐富的色素和次生代謝產(chǎn)物而被關注，在植物病害生物防治領域應用廣泛[16]。課題組分離到的B11-64 菌株不僅對R.solani有較強的抑制作用，且對煙草猝倒病菌、姜白絹病菌、苦瓜枯萎病菌等多種植物病原菌也有抑制作用，說明B11-64 菌株具有防治番茄立枯病以及其他多種病害的潛力。

生防菌的根際定殖能力是衡量生防菌有效防治植物病害的重要參考指標之一。Haggag 等[17]發(fā)現(xiàn)，多粘類芽抱桿菌在花生根部形成生物膜是有效阻止花生褐腐病菌侵入根部的主要原因。試驗結果顯示，B11-64 菌株形成生物膜的能力較強，由此推測其在番茄根際定殖的能力與其對番茄立枯病的防治效果息息相關，但還需后續(xù)開展相關試驗加以驗證。

對植物病原菌菌絲生長的抑制作用是生防菌對植物病害生防潛能的重要形式。研究中的B11-64 菌株可使立枯絲核菌的菌絲結構受到破壞，說明B11-64菌株可分泌一些拮抗物質作用于病原菌菌絲體結構。氫氰酸（HCN）是一種可揮發(fā)性的抗菌物質，可以抑制小麥穎枯菌、條銹菌和尖孢鐮刀菌等的生長增殖[18]。鐵是絕大多數(shù)微生物必需的生長因子，生防菌可以通過產(chǎn)生嗜鐵素獲取環(huán)境中的鐵離子，使病原菌缺鐵而失去致病能力[19]。試驗結果顯示，B11-64 菌株具有分泌HCN 和嗜鐵素的能力，推測這種能力在B11-64菌株防治番茄立枯病中起到一定作用。

假單胞菌分泌的抗生素主要有吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA）、 硝 吡 咯 菌 素（pyrrolnitrin，PRN）、藤 黃 綠 膿 菌 素（pyoluteorin，PLT）、2,4-二 乙 酰 基 間 苯 三 酚（2,4-diacetylphloro glucinol，2,4-DAPG）、綠膿菌素（pyocyanin）等。其中PCA 作為吩嗪類抗生素具有廣譜的細菌和真菌抑制活性，以其作為主要成分的申嗪霉素（shenqinmycin）于2011 年獲得農(nóng)藥正式登記[20]；已廣泛應用的殺菌劑拌種咯（fenpiclonil）和咯菌腈（fludioxonil）就是以PRN 為基礎開發(fā)而成的，是假單胞菌抗生素作為先導化合物研發(fā)農(nóng)用殺菌劑的成功范例[21]。B11-64菌株可以擴增到phzCD基因和prnC基因，但是在粗提物液中只檢測到PCA，沒有檢測到PRN，說明B11-64 菌株可能不產(chǎn)生PRN 或產(chǎn)生能力較弱。此外，B11-64 菌株的PCA 粗提物對立枯絲核菌具有較明顯的抑制作用，而PCA 純品對立枯絲核菌無抑制作用。由此推測，可能B11-64 菌株抑制立枯絲核菌的機制與其產(chǎn)生的PCA 無關，而是粗提物中可能含有其他抑制立枯絲核菌的物質，這有待進一步檢測分析。

綜上所述，課題組從番茄田塊土壤中篩選得到的對番茄立枯病抑制活性較強的菌株B11-64 為綠針假單胞菌，該菌株對多種植物病原菌都具有較好的抑制作用，對番茄立枯病菌具有較強的離體和活體抑制活性，可形成生物膜，能破壞立枯絲核菌的菌絲結構，代謝產(chǎn)生氫氰酸、嗜鐵素以及其他抑菌物質，具有較好的番茄立枯病防治潛力。