UPLC-MS/MS 檢測氟吡菌酰胺在菜豆中的殘留及消解動態

李凱龍，姚燕霞，姜錦林，羅路云，陳武瑛，黃 洪，熊 浩，陳 昂

（1. 湖南省農業科學院植物保護研究所，湖南 長沙 410125；2. 生態環境部南京環境科學研究所，江蘇 南京 210042；3. 長江師范學院，重慶 408100）

菜豆（Phaseolus vulgarisLinn.）是一種特色小宗蔬菜，原產于美洲，現廣泛種植于熱帶至溫帶各地區，中國也有栽培。菜豆用途廣泛，營養豐富，既是中國食品加工工業的原料，也是出口創匯的優質農產品。菜豆生長季節易發生病蟲危害，常見病害有炭疽病、銹病和灰霉病，而目前中國農藥信息網（http://www.icama.org.cn/fwb/index.jhtml）上農藥登記數據中，作物菜豆一欄上僅登記了苯甲·氟酰胺、苯醚甲環唑和氟硅唑3 種殺菌劑，在實際生產中，由于病蟲害防治需要，可能會使用其他殺菌劑。

氟吡菌酰胺（fluopyram）是一種新型的苯甲酰胺類殺菌劑，具有廣譜的殺菌活性，可用于70 多種作物病害的防治，主要用于防治由白粉病菌、灰葡萄孢菌、叢梗孢屬病菌和核盤菌等引起的病害[1]。中國食品中農藥最大殘留限量標準[2]和JMPR 報告（http://www.fao.org/agriculture/crops/thematic-sitemap/theme/pests/lpe/en/）中，關于氟吡菌酰胺的殘留定義描述為氟吡菌酰胺母體，而氟吡菌酰胺在土壤和植物中以母體及代謝物2-（三氟甲基）苯甲酰胺（BZM）的殘留形式廣泛存在。國際食品法典委員會（CAC）規定氟吡菌酰胺在豆類蔬菜（莢可食）中的最大殘留限量（MRLs）為1.0 mg/kg（https://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/home/zh/），歐盟限量規定3.0 mg/kg（https://food.ec.europa.eu/plants/pesti cides/eu-pesticides-database_en），而中國的臨時限量規定為1.0 mg/kg[2]。目前，氟吡菌酰胺及其代謝物的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）[3]、氣相色譜-串聯質譜法[4]和液相色譜-串聯質譜法[5]。國內外關于氟吡菌酰胺在番茄[6]、石榴[7]、草莓[5]等作物上的殘留規律已有少量報道，但在菜豆中的殘留及消解動態研究尚未見報道。因此，筆者擬通過改良的QuEChERS方法提取和分散固相萃取凈化，建立菜豆中氟吡菌酰胺及其代謝物BZM 殘留的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，并通過田間試驗分析其消解動態，為氟吡菌酰胺在菜豆上的安全使用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用儀器包括：Aglien LC1290-MS/MS 超高效液相色譜-質譜聯用系統（ABSCIEX 4500Q，美國Aglien 公司和SCIEX 公司），CPA225D 型電子天平（德國賽多利斯股份公司），Centrifuge 5424 型高速離心機（Eppendorf 艾本德公司），TDL-40B 型低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），微量移液器（Eppendorf艾本德公司），T25 型高速勻漿機（德國IKA）。

試驗樣品包括：41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑（拜耳股份公司），99.4%氟吡菌酰胺標準品（德國Dr.Ehrensorfer 公司），98.0% 2-（三氟甲基）苯甲酰胺（BZM，西格瑪奧德里奇公司），色譜級乙腈和甲醇[默克化工技術（上海）有限公司]，色譜級甲酸（美國ROE），分析級乙腈、乙酸和無水硫酸鎂（國藥集團化學試劑有限公司），C18 凈化劑（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

1.2 田間試驗方法

在長沙縣春華鎮（露地）按照NY/T 788—2018農藥殘留試驗準則[8]的要求進行氟吡菌酰胺及其代謝物BZM 的消解動態試驗，小區面積50 m2，另設相同面積的空白對照。參照該藥劑在黃瓜上的施用量（中國農藥信息網 http://www.icama.org.cn/fwb/index.jhtml），設定氟吡菌酰胺在菜豆上的使用制劑量為70.6 g/hm2（以有效成分含量計算），于菜豆長至成熟個體一半大小時噴霧施藥1 次，分別于施藥后2 h 以及1、3、5、7、14、21、28 d 采樣，每個采樣點設置3 次重復。在試驗小區內隨機采摘生長正常、無病害的菜豆（不少于1 kg）混勻后切碎用四分法取200 g 以上的樣品，并于-20℃冰箱中冷凍保存至分析檢測用。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理稱取10 g 菜豆樣品于100 mL 離心管中，加入50 mL 乙腈，渦旋2 min（2 500 r/min），加入5 g NaCl，搖勻并渦旋1 min（2 500 r/min）后離心5 min（4 000 r/min）。取1.5 mL 上清液到裝有40 mg C18 的2 mL 微量離心管中，離心4 min（12 000 r/min），過0.2 μm 濾膜，待LC-MS/MS 檢測。

1.3.2 儀器條件（1）液相條件：色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18（3 mm×100 mm，1.8 μm）； 柱 溫25℃；流速0.4 mL/min；進樣量1.0 μL；流動相為乙腈/0.1%甲酸水（V/V）溶液，梯度洗脫如表1 所示。（2）質譜條件：離子源類型ESI+；離子源溫度500℃；離子噴霧電壓5 500 V；氣簾氣壓力40 psi；噴霧氣壓力45 psi；輔助加熱氣壓力45 psi；多重反應監測（MRM）質譜參數見表2。

表1 流動相梯度洗脫程序

表2 氟吡菌酰胺和BZM 的質譜測定參數

1.3.3 標準溶液的配制準確稱取氟吡菌酰胺標準品0.010 1 g、BZM 標準品0.010 1 g 分別置于10.0 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，分別配制成1 000.0 mg/L 濃度的標樣儲備液，密封貯存在0～4℃的環境中，根據試驗要求稀釋使用。準確量取氟吡菌酰胺和BZM 母液用乙腈逐級稀釋成0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001 和0.000 5 mg/L 的混合標準溶液。菜豆空白樣品經過前處理得出基質空白溶液，分別配制氟吡菌酰胺和BZM 菜豆基質系列0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001和0.0005 mg/L 濃度的空白基質標準溶液。

1.3.4 添加回收試驗稱取空白菜豆樣本，添加氟吡菌酰胺及代謝物BZM 標準溶液，配置成0.005、0.1和1.0 mg/kg 這3 個添加水平，每一水平設5 次重復，同時設不加藥的空白對照。采用實際添加可達到定量檢測的最小濃度水平為定量限（LOQ），基質校正標準曲線定量，計算添加平均回收率及相對標準偏差。

1.3.5 數據處理氟吡菌酰胺在菜豆中的殘留量變化，采用一級動力學方程表示：

式中，CT為施藥后T時刻菜豆中氟吡菌酰胺的殘留量（mg/kg），C0為施藥后氟吡菌酰胺在菜豆中的動力學方程擬合原始沉積量（mg/kg），k為菜豆中氟吡菌酰胺的消解系數，t為施藥后時間（d）。通過公式（1）計算得到消解系數k，通過公式（2）計算得到氟吡菌酰胺在菜豆中的消解半衰期T1/2（d）。

根據公式（3）計算基質效應（ME）：當-20%＜ME ＜20%時為弱基質效應；當-50%＜ME ≤-20%或20%≤ME ＜50%為中等基質效應，當ME ≤-50%或≥50% 為強基質效應[9]。

式中，km和ks分別為基質標準曲線和溶劑標準曲線的斜率。

2 結果與分析

2.1 分析方法的線性關系、準確度和精密度

以標樣溶液濃度為橫坐標、響應值為縱坐標繪制標準曲線，氟吡菌酰胺和BZM 在溶劑和基質中的標準曲線和相關系數如表3 所示。在試驗設計的濃度范圍（0.000 5～0.2 mg/L）內，氟吡菌酰胺和BZM 在基質中呈良好的線性關系，相關系數為0.992 0～0.999 9。這表明研究建立的殘留分析方法能滿足農藥殘留分析所要求的準確性和重現性。

液相色譜-串聯質譜技術已被廣泛用于農藥殘留檢測中，但作物中的一些提取物可能會產生基質效應而干擾分析結果的準確性與精密度，因此在殘留分析中應考慮不同作物所帶來的基質效應[10-11]。由表3 可知，氟吡菌酰胺和BZM 的基質效應分別為6.6%和-6.0%，屬于弱基質效應。

表3 氟吡菌酰胺和BZM 的線性方程

檢測方法的準確度和精密度分別以方法的添加回收率和相對標準偏差表示。由表4 可知，氟吡菌酰胺在菜豆上的添加回收率為91.5%～98.7%，RSD 為2.3%～4.2%；BZM 在菜豆上的添加回收率為90.5%～96.7%，RSD 為3.3%～10.1%。氟吡菌酰胺和BZM 的方法檢出限（LOD）均為0.000 5 mg/L，而最低檢測濃度（LOQ）均為0.005 mg/kg。在試驗設置的色譜條件下，氟吡菌酰胺和BZM 的色譜峰能較好地與基線分離，且峰形完整，可以滿足農殘分析的要求。

表4 氟吡菌酰胺和BZM 在菜豆樣品中的回收率和檢出限（n=5）

2.2 氟吡菌酰胺在菜豆中的消解動態

由圖1A 可知，使用41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑對菜豆噴霧施藥，菜豆中氟吡菌酰胺的殘留量隨著時間的推移而逐漸降低，氟吡菌酰胺在菜豆上的原始沉積量為0.248 mg/kg；其消解動態符合一級動力學方程：CT= 0.258 1e-0.236t，R2=0.965 3，半 衰 期 為2.9 d，施藥后28 d 消解率分別達99.8%。由圖1B 可知，氟吡菌酰胺代謝物BZM 在菜豆上的殘留量不到母體氟吡菌酰胺的10%且均小于0.005 mg/kg，因此未計算BZM 在菜豆中的半衰期；從其消解動態來看，代謝物BZM 在菜豆上的殘留表現為積累和消解2 個階段，即其含量隨施藥后時間的延長表現出先上升后下降的變化規律，在施藥后第10 天達到最大殘留水平，而后逐漸消解，到施藥后28 d 菜豆上已檢測不出BZM。

圖1 氟吡菌酰胺（A）和BZM（B）在菜豆中的殘留消解動態

3 討論與結論

該研究通過改良的QuEChERS 方法提取和分散固相萃取凈化，建立了菜豆中氟吡菌酰胺及其代謝物BZM 殘留的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，該方法簡單快速、對環境友好，準確度和精密度均符合農藥殘留試驗準則的相關要求。氟吡菌酰胺在菜豆中的半衰期結果（2.9 d）與芒果（4.3～5.4 d）[12]中的半衰期相近，快于西瓜（6.5～6.6 d）[12]、番茄（6.9～7.9 d）[6]、甜椒（7.3 d）[13]、草莓（7.2～8.2 d）[5]和石榴果實（7.3～9.1 d）[7]中的半衰期。這表明氟吡菌酰胺在菜豆中降解速度快、殘留低，屬于容易降解的農藥，為氟吡菌酰胺在菜豆上的安全使用提供了參考數據。目前，我國尚未對氟吡菌酰胺在菜豆上進行登記，氟吡菌酰胺在菜豆上的最大殘留限量也僅是臨時最大殘留限量，建議加強菜豆農藥登記和MRL 的制定工作，保障群眾食品質量安全。