LncRNA BDNF-AS靶向miR-765影響缺氧缺糖誘導的PC12細胞神經損傷的實驗研究

蔣邦治 唐永剛 韓志安 陳林坤 韋家俊

缺血性腦中風是常見的急性腦血管類疾病，也是造成殘疾的主要神經系統疾病，氧化應激、炎性反應、細胞凋亡等系列病理過程參與其發生發展；神經保護治療是缺血性腦卒中最重要、最有效的治療手段[1,2]。研究表明lncRNA參與調控腦缺血后細胞凋亡、血管生成和炎性反應等系列過程，可作為缺血性腦卒中生物標志物[3]。腦源性神經營養因子反義RNA(BDNF-AS)是一種天然反義轉錄物，有報道精神分裂癥患者血清中lncRNA BDNF-AS呈高表達，與認知能力相關指標密切相關[4]。下調LncRNA BDNF-AS表達對布比卡因誘導的幼脊髓背根神經節神經元的毒性損傷有保護作用[5]。沉默LncRNA BDNF-AS通過抑制細胞凋亡和氧化應激來減弱Aβ25-35誘導的PC12細胞神經毒性[6]。敲除LncRNA BDNF-AS可通過BDNF-TrkB-PI3K/Akt信號通路減弱缺氧/復氧誘導的神經細胞凋亡[7]。而LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導的PC12細胞神經損傷的影響及機制尚不清楚。研究表明miRNA在缺血性腦卒中的發生與發展過程中發揮著重要作用，并參與了腦損傷后的保護和修復機制的調控[8]。敲低LncRNA FOXD3-AS1通過miR-765/BCL2L13軸防止腦缺血/再灌注損傷[9]。本實驗研究LncRNA BDNF-AS是否通過調控miR-765影響缺氧缺糖誘導的PC12細胞神經損傷。為神經元損傷的機制以及防治藥物研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細胞(美國ATCC)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；Trizol試劑、熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物)；凋亡檢測試劑盒、蛋白裂解液(艾美捷科技有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海翌圣生物)。

1.2 細胞處理與分組 PC12細胞常規培養于DMEM培養基中，取對數生長期細胞，將其接種于無糖培養液后在含95N2%、5% CO2的培養箱中缺氧缺糖處理12 h，記為模型組，常規培養的細胞作為對照組；將LncRNA BDNF-AS干擾表達載體及陰性對照、miR-765模擬物及陰性對照轉染至PC12細胞后進行缺氧缺糖處理，記為si-LncRNA BDNF-AS+模型組、si-NC+模型組、miR-765+模型組、miR-NC+模型組；將LncRNA BDNF-AS干擾表達載體分別與miR-765抑制劑及陰性對照轉染至PC12細胞后進行缺氧缺糖處理，記為anti-miR-NC+si-LncRNA BDNF-AS+模型組、anti-miR-765+si-LncRNA BDNF-AS+模型組。

1.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LncRNA BDNF-AS和miR-765的表達水平 提取各組細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。以GAPDH和U6為內參，LncRNA BDNF-AS上游引物序列：5’-TCACATCTTAGCCCCTTAGCC-3’，下游引物序列：5’-TTTAGCACCCAACAGAATCCC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物序列：5’-TGCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’；miR-765上游引物序列：5’-CGGCTCGGATCCGTTAG-3’，下游引物序列：5’-CGACTACCGTTAGCTAGA-3’；U6上游引物序列：5’-CGCTTCGGCAGGCATTATATAC-3’，下游引物序列：5’-AAGGGGCCATGCTAATCTT-3’。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，用預冷的PBS漂洗2次，與500 μl的結合緩沖液混勻，然后加入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻、避光孵育10 min；上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 蛋白質印跡法檢測蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，轉膜、封閉后加入Cleaved-caspase3、Bax抗體(1∶800)，4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(1∶2000)室溫孵育2 h，曝光顯影，定影，分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為參照。

1.6 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測MDA、SOD、CAT水平 收集各組細胞及細胞培養上清液，具體按照試劑盒操作進行檢測。

1.7 雙熒光素酶報告實驗 構建含有miR-765結合位點的LncRNA BDNF-AS野生型及突變型報告基因載體，將其分別與miR-NC、miR-765共轉染至PC12細胞，用試劑盒法檢測細胞熒光素酶活性。

2 結果

2.1 缺氧缺糖誘導的PC12細胞中LncRNA BDNF-AS和miR-765的表達水平 與對照組相比，模型組LncRNA BDNF-AS表達水平升高，miR-765表達水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 缺氧缺糖誘導的PC12細胞中LncRNA BDNF-AS和miR-765的表達水平

2.2 低表達LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導的PC12細胞神經損傷的影響 與對照組相比，模型組LncRNA BDNF-AS表達水平升高，PC12細胞凋亡率以及Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達水平升高，MDA含量升高，SOD和CAT活性降低(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-LncRNA BDNF-AS+模型組LncRNA BDNF-AS表達水平降低，PC12細胞凋亡率以及Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達降低，MDA含量降低，SOD和CAT活性升高(P<0.05)。見表2，圖1、2。

圖1 低表達LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導的PC12細胞凋亡的影響

表2 低表達LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導的PC12細胞神經損傷的影響

2.3 LncRNA BDNF-AS靶向調控miR-765的表達 LncBase Predicted v.2預測顯示LncRNA BDNF-AS和miR-765有結合位點。miR-765與LncRNA BDNF-AS野生型報告質粒共轉染后PC12細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)。與pcDNA-NC比較，pcDNA-LncRNA BDNF-AS組LncRNA BDNF-AS表達水平升高，miR-765表達水平降低(P<0.05)；與si-NC比較，si-LncRNA BDNF-AS組LncRNA BDNF-AS表達水平降低，miR-765表達水平升高(P<0.05)。見圖3，表3、4。

圖2 低表達LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導的PC12細胞相關蛋白表達的影響

圖3 LncBase Predicted v.2對LncRNA BDNF-AS和miR-765結合進行預測示意圖

表3 miR-NC或miR-765與LncRNA BDNF-AS野生型及突變型報告質粒共轉染PC12細胞后雙熒光素酶活性

表4 qRT-PCR檢測miR-765和LncRNA BDNF-AS的表達

2.4 miR-765對缺氧缺糖誘導的PC12細胞神經損傷的影響 與miR-NC+模型組比較，miR-765+模型組miR-765表達水平升高，PC12細胞凋亡率以及Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達水平降低，MDA含量降低，SOD和CAT活性升高(P<0.05)。見圖4，表5。

表5 miR-765對缺氧缺糖誘導的PC12細胞神經損傷的影響

圖4 miR-765對缺氧缺糖誘導的PC12細胞凋亡以及相關蛋白表達的影響；A 流式細胞儀檢測細胞凋亡；B Western blot檢測Cleaved-caspase-3、Bax蛋白的表達

2.5 anti-miR-765可以逆轉低表達LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導的PC12細胞神經損傷的影響 與anti-miR-NC+si-LncRNA BDNF-AS+模型組比較，anti-miR-765+si-LncRNA BDNF-AS+模型組miR-765表達水平降低，PC12細胞凋亡率以及Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達水平升高，MDA含量升高，SOD和CAT活性降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5，表6。

表6 anti-miR-765可以逆轉低表達LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導的PC12細胞神經損傷的影響

圖5 anti-miR-765可以逆轉低表達LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導的PC12細胞凋亡以及相關蛋白表達的影響；A 流式細胞儀檢測細胞凋亡；B Western blot檢測Cleaved-caspase-3、Bax蛋白的表達

3 討論

缺血性腦卒中是腦組織血液供應障礙導致腦組織局限性或彌漫性缺血缺氧，一種缺血性腦血管疾病，死亡率和致殘率較高，研究在缺血性腦卒中的發生發展機制，尋找重要治療靶點以開發藥物促進神經功能恢復，為臨床策略提供寶貴的見解[10,11]。有研究報道抑制LncRNA BDNF-AS可挽救缺氧/復氧損傷的小鼠心肌細胞中的細胞死亡和凋亡[12]。敲低LncRNABDNF-AS通過miR-130b-5p/PRDM5 軸在急性脊髓損傷中抑制神經元細胞凋亡[13]。沉默LncRNA BDNF-AS可減輕缺氧/缺血引起的新生兒腦損傷[14]。抑制LncRNA BDNF-AS通過增加BDNF的水平來保護視網膜神經節細胞免受缺血損傷[15]。以上研究表明LncRNA BDNF-AS參與調控多種細胞損傷過程。本結果顯示，缺氧缺糖誘導的PC12細胞中LncRNA BDNF-AS表達水平升高(P<0.05)；抑制LncRNA BDNF-AS表達后，PC12細胞凋亡率、Cleaved-caspase3和Bax表達水平降低(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)，SOD和CAT活性升高(P<0.05)；表明抑制LncRNA BDNF-AS表達可抑制缺氧缺糖誘導的PC12細胞凋亡和氧化應激；提示抑制LncRNA BDNF-AS表達可保護PC12細胞免受缺氧缺糖誘導的損傷。這與其他研究中LncRNA BDNF-AS的作用相似。

生物學軟件預測發現LncRNA BDNF-AS與miR-765有結合位點。有研究報道miR-765在中樞神經系統腫瘤中下調表達[16]。LINC00173通過靶向miR-765/NUTF2軸促進膠質瘤進展[17]。本結果顯示，缺氧缺糖誘導的PC12細胞中miR-765表達水平降低；過表達miR-765后，PC12細胞凋亡率、Cleaved-caspase3和Bax表達水平降低，MDA含量降低，SOD和CAT活性升高；表明過表達miR-765可抑制缺氧缺糖誘導的PC12細胞凋亡和氧化應激。且本實驗還證實LncRNA BDNF-AS靶向調控miR-765；而抑制miR-765可以逆轉低表達LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導的PC12細胞神經損傷的影響。

綜上所述，抑制LncRNA BDNF-AS表達通過靶向調控miR-765抑制缺氧缺糖誘導的PC12細胞神經損傷。