藜麥啤酒工藝優化及其理化品質與抗氧化活性分析

周亞麗，游新勇*，崔利華，陳建光，李曉龍，劉慧，劉江山，方曉雪

（1.安陽工學院 生物與食品工程學院，河南 安陽 455000；2.安陽工學院 機械工程學院，河南 安陽 455000）

藜麥（Chenopodiun quinoa Willd.），屬于藜科，是安第斯山區的主要糧食作物之一，已有數千年的種植歷史[1]。藜麥是一種無麩質的假谷物，近年來因其較高的營養價值和健康功效而受到廣泛關注[2]。研究表明，藜麥含有豐富的優質蛋白質、氨基酸、維生素、礦物質、多糖、不飽和脂肪酸及其他微量元素[3]。同時，藜麥含有多種生物活性成分，包括多酚、總黃酮、皂苷等，具有較強的抗氧化活性[4-6]，能夠降低氧化應激相關疾?。ㄈ缣悄虿　┌Y和肥胖癥）發生的風險，因此，藜麥可作為開發功能性食品的主要原料[7-8]。

啤酒是一種低濃度酒精飲料，主要以麥芽為原料，然后經過糖化、過濾、麥汁煮沸和冷卻等工藝發酵而成。近年來，啤酒的類型和釀制工藝也在不斷優化改進，研究人員將雜糧應用到啤酒釀造中，研制了蕎麥啤酒、薏米啤酒、青稞啤酒等[9-11]，這些谷物啤酒既有谷物的特殊香味，又保留了谷物自身的營養價值[12-13]。但關于藜麥啤酒的釀造及其深入研究鮮見報道。

藜麥是目前發現的唯一的無麩質堿性食物，胚芽占種子的比例較大，為68%[14]。藜麥發芽后能顯著提高營養物質及總酚、總黃酮、皂苷等活性物質含量，易于人體吸收，已被廣泛用于食品加工等領域[15-18]。研究人員通過正交試驗或響應面分析等方法優化了藜麥復合高纖維蛋白飲品、藜麥多谷物代餐粉、藜麥黃酒的配方或工藝條件[19-21]。研究表明，藜麥黃酒中可溶性蛋白、總酚、總黃酮含量均顯著提高，且藜麥黃酒中的揮發性成分比燕麥黃酒中的揮發性成分多[22-23]，同時，總酚和總黃酮在清除自由基方面效果顯著[21]。將藜麥添加到啤酒釀造過程中，可使藜麥的營養價值有效地發揮出來，制作出營養價值高、風味獨特且具有生物功效的大眾酒飲品。

本試驗以大麥、藜麥為原料，運用單因素試驗和響應面分析方法，優化藜麥啤酒的最佳釀造工藝。同時，測定藜麥啤酒中總酚、總黃酮的含量及抗氧化活性，為藜麥深加工產品的開發提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

藜麥：山東老鄉生態農業有限公司，產自青海省；大麥、卡斯卡特啤酒花：鄭州龍海啤酒物資有限公司，產自美國；S-04酵母：比利時弗曼迪斯酵母有限公司；無水乙醇、沒食子酸、福林酚試劑、無水碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、蘆丁標準品、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、鄰苯三酚、水楊酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：天津市科密歐化學試劑有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

9684麥芽研磨器：山東工大機械有限公司；KOGV328A高精度恒溫糖化鍋：杭州正久機械制造股份有限公司；1.5 m硅膠吸虹器、30 L美式啤酒發酵桶：煙臺帝伯仕啤酒技術有限公司；LQJ 304不銹鋼冷卻盤管：深圳市海新萊實業有限公司；1.0～1.1糖度比重計：北京博科技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藜麥啤酒釀造工藝流程

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 藜麥添加量的確定

設置藜麥添加量分別為0%、15%、25%、35%、45%、55%、65%，發酵時間為16 d，糖化溫度為70℃，進行啤酒發酵，發酵完成后，對啤酒進行感官評定，并測定啤酒中總酚和總黃酮含量，考察不同藜麥添加量對藜麥啤酒感官品質的影響。

1.3.2.2 發酵時間的確定

設置藜麥啤酒的發酵時間分別為13、14、16、18、19 d，藜麥添加量為55%，糖化溫度為70℃，進行啤酒發酵，發酵完成后，對啤酒進行感官評定，并測定啤酒中總酚和總黃酮含量，考察不同發酵時間對藜麥啤酒感官品質的影響。

1.3.2.3 糖化溫度的確定

設置藜麥啤酒糖化溫度分別為 60、65、70、75、80℃，藜麥添加量為55%，發酵時間為16 d，進行啤酒發酵，發酵完成后，對啤酒進行感官評定，并測定啤酒中總酚和總黃酮含量，考察不同糖化溫度對藜麥啤酒感官品質的影響。

1.3.3 響應面法優化藜麥啤酒發酵工藝

根據單因素試驗結果，依據Box-Behnken中心試驗設計原理設計響應面試驗，以感官評分為響應值，以藜麥添加量、發酵時間、糖化溫度作為自變量，試驗因素和水平見表1。

表1 響應面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.4 感官評定

參照國家標準GB/T 4927—2008《啤酒》，運用綜合評分法從外觀、泡沫性能、香氣、口感4個方面對藜麥啤酒品質進行感官評定。選取10位身體健康且無不良嗜好的食品專業學生和老師組成感官評定小組，年齡在18歲～29歲之間，均接受過啤酒評定方面的專業訓練，對制得的藜麥啤酒進行評分，總分100。藜麥啤酒感官評分標準見表2。

表2 藜麥啤酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of quinoa beer

1.3.5 藜麥啤酒基本理化指標的測定

1.3.5.1 總糖含量的測定

葡萄糖標準曲線的制作：準確稱取100 mg無水葡萄糖，用蒸餾水定容至100 mL，得到1 mg/mL標準溶液。分別吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 葡萄糖標準溶液于試管中，加蒸餾水補充至2 mL，加入6 mL蒽酮試劑，混勻，放沸水中加熱15 min，冷卻，于625 nm處測吸光值，吸光值作為縱坐標，溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程y=2.728 6x+0.069 7（R2=0.999 6）。每組試驗重復3次。

藜麥啤酒中總糖含量的測定采用蒽酮-硫酸比色法。分別吸取藜麥啤酒樣品溶液2 mL于試管中，分別加入6 mL蒽酮試劑，混勻，沸水浴15 min，冷卻，于625 nm處測吸光值，根據標準曲線的回歸方程計算樣品中總糖含量。

1.3.5.2 總酸含量的測定

啤酒中總酸含量的測定參考國家標準GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》中的第一法。

1.3.5.3 酒精度的測定

啤酒中酒精度的測定采用GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中的密度瓶法。

1.3.6 藜麥啤酒活性成分測定

1.3.6.1 藜麥啤酒酚類物質提取液的制備

分別吸取5 mL藜麥啤酒樣品，加入45 mL乙醇（60%～70%），混合均勻，60℃超聲輔助提取80 min后，在溫度4℃、轉速4 000 r/min條件下離心15 min，收集濾液，濃縮冷卻后，用乙醇定容到20 mL。

1.3.6.2 藜麥啤酒總酚含量的測定

藜麥啤酒中總酚含量的測定采用福林肖卡法[24-25]，提取物中總酚含量表示為沒食子酸當量，單位記為μg/mL。

沒食子酸標準曲線的制作：準確稱取沒食子酸標準品25 mg，用蒸餾水定容至250 mL，得到0.1 mg/mL對照溶液。分別吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 10 mL 的容量瓶中，加入2 mL福林酚，混合均勻后再加入4 mL 7.5%Na2CO3溶液，定容，搖勻后避光反應1 h，測定765 nm處的吸光值。吸光值作為縱坐標，溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程y=0.088 3x+0.042 8（R2=0.999 5）。每組試驗重復3次。

1.3.6.3 藜麥啤酒總黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定采用Z?otek等[18]的方法，并稍加修改，提取物中總黃酮含量表示為蘆丁當量，單位記為μg/mL。

蘆丁標準曲線的制作：準確稱取蘆丁標準品20mg，用60%乙醇定容至10 mL，吸取5.0 mL，置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得到200 μg/mL標準溶液。分別吸取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 對照溶液于 15 mL試管中，用蒸餾水補充至5 mL，加入0.5 mL 5%的NaNO2溶液，混合均勻，反應6 min。加入0.5 mL 10%Al（NO3）3溶液，混合均勻，反應6 min。加入4 mL 4%NaOH溶液，搖勻后反應20 min，測定510 nm處吸光值。以吸光值為縱坐標，溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程 y=0.004 9x+0.016 5（R2=0.999 7）。每組試驗重復3次。

1.3.7 DPPH·清除能力的測定

DPPH·清除能力測定參考Hirose等[26]的方法，并稍加修改。將多酚提取液配制成濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 的溶液，分別吸取 2.0 mL不同濃度的提取溶液置于10 mL比色管中，再加入0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液2.0 mL，混合均勻，避光靜置15 min，于517 nm處測定吸光值記為A1；以2.0 mL蒸餾水溶液代替0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液，測定吸光值記為A2；以2.0 mL蒸餾水代替樣液，測定吸光值記為A0。DPPH·清除率計算公式如下。

DPPH·清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.4 數據處理

使用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 17.0軟件分別進行數據處理和顯著性分析（p<0.05），使用Origin 2016軟件繪圖，采用Minitab和Design-Expert軟件進行響應面分析。數據采用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 藜麥添加量對藜麥啤酒感官品質的影響藜麥添加量對啤酒感官品質的影響見表3。

表3 藜麥添加量對啤酒感官品質的影響Table 3 The effect of quinoa addition amount on sensory quality of beer

由表3可知，隨著藜麥添加量的增加，藜麥啤酒的外觀和香氣評分呈現先增高后降低的趨勢，色澤呈現淡黃色，與卞猛[27]的研究結果一致。藜麥添加量為55%時，感官評分達到最大值，此時，啤酒酒體飽滿，柔和爽口，且二氧化碳的殺口感較強，感官品質最高。因此，選擇藜麥添加量為45%、55%、65%進行后續試驗。

2.1.2 發酵時間對藜麥啤酒感官品質的影響

發酵時間對啤酒感官品質的影響見表4。

表4 發酵時間對啤酒感官品質的影響Table 4 The effect of fermentation time on sensory quality of beer

由表4可知，當發酵13 d時，藜麥啤酒各項指標雖達到啤酒的感官標準，但相比于發酵16 d的藜麥啤酒，啤酒的香氣較弱，外觀澄清度、泡沫性能較差，感官評分較低。發酵16 d的藜麥啤酒，其外觀、香氣、口感均較好，且感官評分達到最大值。隨著發酵時間的繼續延長，啤酒的澄清度下降，泡沫性能和香氣減弱。因此，選擇發酵時間為14、16、18 d進行后續的試驗。

2.1.3 糖化溫度對藜麥啤酒感官品質的影響

糖化溫度對啤酒感官品質的影響見表5。

表5 糖化溫度對啤酒感官品質的影響Table 5 The effect of saccharification temperature on sensory quality of beer

由表5可知，糖化溫度對藜麥啤酒的口感影響較大。糖化溫度在70℃時，口感最佳。隨著糖化溫度的增加，藜麥啤酒的泡沫性能有所減弱，80℃時，口感和泡沫性能均較差，且感官評分較低。因此，選擇糖化溫度為65、70、75℃進行后續的試驗。

2.2 響應面分析優化藜麥啤酒發酵工藝

2.2.1 響應面優化試驗結果

通過Design-Expert軟件對藜麥啤酒發酵工藝進行優化試驗設計及分析，響應面試驗結果見表6，方差分析結果見表7。

表6 響應面分析試驗設計與結果Table 6 Design and results of response surface test

通過多元回歸分析，得到二次多項擬合方程為Y=84.28+2.48A-1.39B-4.14C+3.20AB-2.85AC-1.08BC-3.20A2-2.78B2-6.38C2。

由表7可知，多元二次模型p＜0.000 1，表明該回歸模型極顯著；失擬項p=0.030 1＜0.05，差異顯著；相關系數R2=0.980 8，說明該方程擬合度較好，可用該模型預測藜麥啤酒感官評分的變化。顯著性檢驗結果表明，A、C、AB、AC、A2、B2、C2影響極顯著（p＜0.01），而 BC項對藜麥啤酒的感官品質影響不顯著（p＞0.05）。各因素對藜麥啤酒感官品質的影響次序依次為藜麥添加量（A）＞糖化溫度（C）＞發酵時間（B），即藜麥添加量對藜麥啤酒感官評分的影響程度最大。

表7 方差分析結果Table 7 The results of analysis of variance

各因素交互作用的響應面圖見圖1。

響應曲面圖可直觀反映各因素交互作用對藜麥啤酒感官品質的影響程度，曲面越陡峭說明影響越大，相反，越平緩說明影響越弱。由圖1可以看出，藜麥添加量與發酵時間、藜麥添加量與糖化溫度之間交互作用的響應面較陡峭，說明藜麥添加量與發酵時間、藜麥添加量與糖化溫度交互作用顯著，這與方差分析結果一致。

圖1 兩因素交互作用對藜麥啤酒感官評分影響的響應面圖Fig.1 Response surface plots showing the interaction effects of factors on the sensory score of quinoa beer

2.2.2 藜麥啤酒最佳發酵工藝條件的確定

根據模型擬合，得到最佳的工藝參數為藜麥添加量54.55%，發酵時間15.58 d，糖化溫度70.40℃，得到的藜麥啤酒感官評分為86.096。為了方便實際操作，調整最佳工藝參數為藜麥添加量55%，發酵時間16 d，糖化溫度70℃，并在此條件下進行3次平行驗證試驗，結果表明，得到的藜麥啤酒感官評分為86.0±0.1。試驗結果與模型預測值相近，說明試驗設計預測的試驗參數比較精準，證明結果合理可靠。

2.3 藜麥啤酒理化指標的測定結果

對未添加藜麥和最優工藝下制得藜麥啤酒的理化指標進行對比分析，結果見表8。

由表8可知，藜麥啤酒的酒精度、總糖含量顯著高于未添加藜麥的啤酒，總酸含量顯著低于未添加藜麥的啤酒。此外，藜麥啤酒中總酚、總黃酮含量顯著高于未添加藜麥的啤酒，這與Carciochi等[28]的研究結果一致。同時，藜麥啤酒中DPPH·的清除能力也顯著高于未添加藜麥的啤酒，且其清除DPPH·能力的IC50值為39.65 mg/mL，說明藜麥的添加顯著提高了藜麥啤酒中酚類物質的含量，進而直接影響藜麥啤酒的抗氧化活性。

表8 產品理化指標測定結果Table 8 Measurement results of physical and chemical indexes of products

3 結論

通過單因素試驗和響應面試驗優化發酵工藝，確定最佳發酵工藝條件為藜麥添加量55%，發酵時間16 d，糖化溫度70℃，該條件下藜麥啤酒的感官評分為86.0±0.1，與預測值誤差在1%內，得到的回歸方程合理可靠，具有可行性。同時，此工藝條件下，藜麥啤酒中總糖含量為0.65 mg/mL、總酸含量為11.52 g/L、酒精度為1.64%vol，總酚、總黃酮含量分別為5.44、79.00 μg/mL，且 DPPH·清除率為 76.60%，DPPH·清除能力的IC50值為39.65 mg/mL。本試驗結果為藜麥產品深加工提供了一定的參考。