荔枝核總黃酮通過JAK2/STAT3信號通路抗大鼠肝纖維化的實驗研究*

歐士鈺，杜 凌，韋 捷，陳 剛

柳州市工人醫院消化內科，廣西柳州 545007

肝纖維化是各種慢性肝病進一步向肝硬化發展的必經階段，是肝臟細胞外基質(ECM)合成與降解平衡紊亂，導致ECM過度沉積的病理過程[1]。目前研究認為，肝纖維化乃至早期肝硬化是可以逆轉的[2-3]。荔枝核總黃酮(TFL)是從荔枝核中提取的有效藥理成分，研究表明TFL具有抗肝纖維化作用，其機制與TFL可抑制核因子κB p65(NF-κB p65)蛋白表達有關[4]。酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)/信號轉導及轉錄激活因子3(STAT3)信號通路的激活與促肝纖維化作用密切相關[5-6]。目前，TFL對JAK2/STAT3信號通路是否有干預作用尚鮮見報道，TFL是否通過該信號通路發揮抗肝纖維作用尚未明確。本研究旨在觀察TFL對JAK2/STAT3信號通路的影響，進一步探討TFL抗肝纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠30只，雄性，SPF級，體重(200±20)g，由中山大學實驗動物中心提供(合格證號：SCXK粵2021-0029)。

1.2儀器與試劑 儀器：酶標儀及凝膠成像系統(美國賽默飛世爾科技公司)；電泳儀、電泳槽(美國Bio-Rad公司)；光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。試劑：TFL(南京澤朗醫藥科技有限公司，純度80%)；二甲基亞硝胺(DMN，美國Sigma-Aldrich公司)；天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、羥脯氨酸(HYP)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制、磷酸酶抑制劑(碧云天生物科技有限公司)；磷酸化JAK2(p-JAK2)抗體、JAK2抗體、磷酸化STAT3(p-STAT3)抗體、STAT3抗體(CST公司)；α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體、膠原-Ⅰ(Collagen-Ⅰ)抗體(Proteintech公司)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物科技公司)。

1.3方法

1.3.1模型制備及給藥 采用隨機數字表法將30只大鼠分為空白對照組、模型組、TFL組，各10只。模型組、TFL組大鼠按Ala-Kokko方法[7]腹腔注射DMN(0.5%，2 mL/kg)建立肝纖維化模型，共4周，空白對照組不造模。造模同時，TFL組大鼠分別灌胃相應受試藥物(TFL，200 mg/kg)，空白對照組及模型組灌服等體積生理鹽水，共6周，每天1次。6周后處死大鼠，取血標本和肝組織標本備用。

1.3.2酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測ALT、AST、HYP水平 將收集到的血標本靜置后，3 000 r/min 離心5 min，取血清；取50 mg肝組織標本，勻漿后3 000 r/min 離心15 min，取上清。按照試劑盒說明書檢測血清AST、ALT水平和肝組織HYP水平。

1.3.3肝組織病理學檢查 常規10%甲醛固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后制備切片，經HE染色、Masson染色后，于光鏡下觀察病理改變。

1.3.4Western blot檢測p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、α-SMA、Collagen-Ⅰ 蛋白的表達 取適量肝組織剪碎后冰上裂解，低溫離心后取上清獲得組織總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，上樣、電泳、轉膜、封閉、洗膜，加入相應的稀釋的抗體，4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育1 h。增強型化學發光(ECL)顯影，凝膠成像系統曝光，Image-J軟件分析目的蛋白的相對表達量。以GAPDH為內參，至少進行3次獨立重復實驗。

2 結 果

2.1TFL對肝纖維化大鼠AST、ALT、HYP水平的影響 與空白對照組比較，模型組AST、ALT、HYP水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，TFL組 ALT、AST、HYP水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組AST、ALT及HYP水平比較

2.2TFL對肝纖維化大鼠肝組織病理學改變的影響 空白對照組大鼠肝臟組織肝細胞索排列整齊，肝細胞形態正常，無水腫，無脂肪變性，小葉結構正常，未見纖維間隔，匯管區未見膠原沉積。與空白對照組比較，模型組肝細胞索排列紊亂，肝細胞水腫，脂肪變性，多數正常小葉結構破壞或消失，形成假小葉。與模型組相比，TFL組肝細胞壞死明顯減少，假小葉消失。見圖1、2。

2.3各組肝纖維化大鼠肝組織JAK2/STAT3信號通路的變化 Western blot檢測結果顯示，模型組肝組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3的表達較空白對照組明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，TFL組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3的表達不同程度降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝組織JAK2/STAT3信號通路的表達情況

2.4各組肝纖維化大鼠肝組織α-SMA、Collagen-Ⅰ蛋白表達 Western blot檢測結果顯示，肝纖維化模型組肝組織α-SMA、Collagen-Ⅰ蛋白的表達較空白對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，TFL組α-SMA、Collagen-Ⅰ的表達不同程度降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

注：A為空白對照組；B為模型組；C為TFL組。

注：A為空白對照組；B為模型組；C為TFL組。

表3 各組大鼠肝組織α-SMA、Collagen-Ⅰ表達的變化

3 討 論

肝纖維化是各種原因的慢性肝病向肝硬化發生、發展過程中的一個重要階段，多種病因如炎癥、乙醇、化學毒物、寄生蟲、乙型肝炎病毒、膽汁淤積及膽道梗阻等，均可以使肝臟發生纖維化，如果這些因素持續存在，可使肝纖維化發展至肝硬化，甚至肝癌[1]。但是，如果在肝纖維化早期階段去除或抑制這些病因，肝纖維是可以緩解甚至逆轉的[2]。中醫藥在抗肝纖維化領域具有很大優勢，TFL具有抗肝纖維化及保肝作用，但其具體機制尚不完全清楚。

本研究建立大鼠肝纖維化動物模型，進一步研究TFL抗肝纖維化作用及其機制。DMN是一種化學毒物，具有肝毒性，可以在肝細胞線粒體中代謝為乙醛，進而與蛋白質交聯；也可代謝產生活性甲基化基因，引起核酸、蛋白質的甲基化，使肝細胞壞死凋亡，DMN還可通過氧化應激使肝臟脂質過氧化，刺激肝星狀細胞(HSC)活化，使細胞外基質膠原蛋白產物增多或降解減少，膠原過度沉積，導致肝纖維化發生、發展。DMN誘導的肝纖維化動物模型膠原沉積與人類肝硬化早期改變的病理特點非常相似，是目前進行肝纖維研究的常用動物模型[7-8]。

本研究中肝模型組肝組織病理切片提示肝索排列紊亂，有較多的成纖維細胞出現，纖維結締組織增生，纖維間隔形成，提示大鼠肝纖維化模型復制是成功的。本研究結果顯示，與模型組比較，TFL治療干預6周后，TFL組大鼠血清ALT、AST、HYP及α-SMA、Collagen-Ⅰ蛋白表達均降低(P<0.05)，且病理結果提示，TFL能改善肝組織損傷及纖維化程度，提示TFL有較好的治療肝纖維化及保肝作用，與相關報道一致[9]。

有研究認為，JAK2/STAT3信號通路與肝纖維化密切相關，HSC的活化是肝纖維進程關鍵的關鍵因素[2，5-6]，HSC膜上特異性受體亞單位與血小板源生長因子、瘦素、轉化生長因子β等促肝纖維化細胞因子發生同源或異源寡聚化后，從而使與受體偶聯的JAKs被激活，繼而使受體細胞質段的酪氨酸磷酸化為含SH2的蛋白停泊位點，下游信號蛋白分子被激活使靶基因發揮作用，STAT蛋白末端的酪氨酸殘基(Tyr705)、絲氨酸殘基(Ser727)同時可被JAKs誘導而發生磷酸化，進而激活STATs蛋白，形成同源或異源STATs蛋白二聚體進入細胞核結合相應靶基因的啟動子，從而使靶基因轉錄活化HSC，參與肝纖維化發生、發展[5，10-11]。本研究結果顯示，肝纖維化模型組肝組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白較空白對照組明顯升高，提示DMN所誘導大鼠肝纖維化過程中大鼠肝組織JAK2/STAT3 信號通路活化，參與了肝纖維化的發生、發展過程；TFL組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3較空白對照組降低，提示TFL可抑制JAK2/STAT3信號通路。因此，筆者認為JAK2/STAT3至少部分參與了肝纖維化的形成，TFL可能通過抑制轉錄因子JAK2/STAT3而發揮抗肝纖維化作用。

TFL對DMN誘導的肝纖維化具有較好的治療作用，有可能逆轉肝纖維化,其機制可能與抑制JAK2/STAT3蛋白的表達，阻斷JAK2/STAT3信號通路的信號傳導有關，但肝纖維化的形成機制極其復雜，TFL抗肝纖維化的作用機制仍需進一步深入研究。