血液標本處理方式對IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2檢測結果的影響*

朱鈺力，談運長，汪 紅，毛衛(wèi)未，周會祥，胡志堅，徐 煒△

九江學院附屬醫(yī)院：1.檢驗科；2.胃腸外科,江西九江332000

血液中細胞因子是診斷疾病、監(jiān)測治療反應和疾病進展的重要生物標志物[1-4]。然而，血液中的細胞因子往往呈低水平狀態(tài)，標本處理對血漿細胞因子檢測結果會產(chǎn)生重大的影響[5]。有研究顯示，在血漿從全血分離之前，白細胞可以在體外繼續(xù)分泌細胞因子并改變其在血漿中的水平[6]。此外，血小板活化可能伴有細胞因子的釋放，可能導致血漿中細胞因子水平明顯升高[6]；細胞因子的穩(wěn)定性也可能對檢測結果產(chǎn)生重大的影響，如一些細胞因子的半衰期特別短，溫度不穩(wěn)定，容易被蛋白降解[7]。因此，探討合適的血漿細胞因子檢測的標本處理方法具有重要的意義。

1 資料與方法

1.1血液標本的采集 本研究使用的血液標本來自本院就診的30例志愿者，本研究中的血液離心均為室溫下3 000 r/min離心20 min。每位志愿者的全血標本被分裝到1～7號乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，其中1號試管全血標本被采集后立即3 000 r/min離心20 min，取血漿0.5 mL，并檢測血漿中白細胞介素(IL)-6、IL-10、γ干擾素(IFN-γ)和IL-2水平，作為對照組，2～6號試管的血液標本根據(jù)實驗要求給予不同的處理。所有志愿者簽署知情同意書，該研究得到了九江學院附屬醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2方法

1.2.1全血在室溫(25 ℃)或4 ℃保存下的處理方法 為檢測在室溫或4 ℃保存下全血中細胞因子的穩(wěn)定性，每位志愿者的2號試管全血于室溫下保存，3號試管全血于4 ℃下保存，保存6、12、24 h后取出部分全血，離心取血漿，檢測血漿中的IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2水平。

1.2.2血漿在室溫或4 ℃保存下的處理方法 為檢測在室溫或4 ℃保存下血漿中細胞因子的穩(wěn)定性，每位志愿者的4、5號試管全血采集后立即離心收集血漿，血漿分別于室溫或4 ℃保存，保存6、12、24 h后取出血漿0.5 mL，并檢測IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2水平。

1.2.3強力處理導致輕度溶血的處理方法 為檢測強力處理后全血細胞因子的穩(wěn)定性，每位志愿者的6號試管全血在50 cm的距離左右反復搖動，導致輕度溶血，然后離心收集血漿，檢測細胞因子的水平。

1.2.4反復凍融的處理方法 為檢測凍融對標本細胞因子的影響，每位志愿者的7號試管全血采集后立即離心收集血漿，然后于-80 ℃冰凍，每8小時將血漿在室溫下解凍1 h后再次冷凍，該過程連續(xù)重復3次，然后測定血漿中IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2的水平。

1.2.5血漿細胞因子的檢測方法 人Th1/Th2/Th17亞群檢測試劑盒購自江西賽基生物技術有限公司，采用BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀按配套試劑盒標準操作流程檢測血漿中的細胞因子(IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2)水平。

1.3統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 7.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并繪制相應圖表，呈非正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以M(P25,P75)表示，采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1全血在室溫或4 ℃保存下細胞因子的穩(wěn)定性 與保存前比較，全血在室溫保存下4種細胞因子水平均有所下降，特別是保存12 h時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；全血在4 ℃保存時，4種細胞因子有較好的穩(wěn)定性，當保存6、12 h時，4種細胞因子水平均較穩(wěn)定，與保存前比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；當保存24 h時，IL-6、IFN-γ與保存前比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 全血在室溫(25 ℃)或4 ℃保存下細胞因子的穩(wěn)定性[n=30,M(P25,P75)，pg/mL]

2.2血漿在室溫或4 ℃保存下細胞因子的穩(wěn)定性 血漿在常溫下保存12 h，4種細胞因子較保存前明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；血漿在4 ℃下保存有較好的穩(wěn)定性，當保存24 h時，IFN-γ、IL-2水平較保存前下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 血漿在室溫(25 ℃)或4 ℃保存下細胞因子的穩(wěn)定性[n=30,M(P25,P75)，pg/mL]

2.3強力處理或反復凍融后全血細胞因子的穩(wěn)定性 與保存前比較，強力處理或反復冰融后血漿4種細胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 強力處理或反復凍融后全血細胞因子的穩(wěn)定性[n=30,M(P25,P75)，pg/mL]

3 討 論

細胞因子包括IL、IFN、生長因子、趨化因子家族、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、轉化因子家族及其他[8]。眾多細胞因子在體內通過旁分泌、自分泌或內分泌等方式發(fā)揮作用，具有高效性、協(xié)同性、拮抗性等多種生理特性，形成了十分復雜的細胞因子調節(jié)網(wǎng)絡，參與人體多種重要的生理功能[9]。多項研究顯示，血液中細胞因子表達水平變化具有重要的生物學意義，使其成為診斷疾病、監(jiān)測治療反應和疾病進展的重要生物標志物[10-13]。

汪廉等[10]研究顯示，Th2類細胞因子是毛細支氣管炎嚴重程度的影響因素，IL-35及Th2類細胞因子可用于輔助判斷毛細支氣管炎的嚴重程度。SINGH等[11]通過對PubMed、Medline和Google Scholar數(shù)據(jù)庫進行檢索，對19篇符合納入標準的文章進行系統(tǒng)分析，結果顯示患者血液中細胞因子水平可能是前列腺癌急性放射治療誘導毒性的預測生物標志物，以及腫瘤組織中細胞因子的過度表達可能成為前列腺癌患者臨床預后的獨立預測指標。GUNAWARDENE等[12]的一項Meta分析也顯示，多種細胞因子綜合評分有可能成為結直腸癌的預后指標。

一方面，全血含有可以分泌細胞因子的白細胞，這可能導致細胞因子水平升高；另一方面，淋巴細胞來源的可溶性受體結合可能導致細胞因子水平降低[14]。全血中細胞因子的降解或不穩(wěn)定也可能導致細胞因子水平下降。在本研究中，全血在室溫或4 ℃下儲存6、12或24 h后，檢測其IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2水平，結果顯示，與保存前比較，全血在室溫下保存12 h，4種細胞因子的水平均顯著下降(P<0.05)；全血在4 ℃下保存時，4種細胞因子水平相對穩(wěn)定，當保存24 h時，僅有IL-6、IFN-γ水平較保存前明顯下降(P<0.05)。這提示在室溫下儲存全血可能影響細胞因子的測量結果。

本研究進一步評估了血漿在室溫或4 ℃下保存下的細胞因子穩(wěn)定性。結果顯示，血漿4 ℃下保存，血漿中IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2的穩(wěn)定性較好。因此，為了防止由于標本處理方式而導致的細胞因子測量的變化，全血采集后盡快離心成血漿，并在冷藏下保存。

在臨床實驗室中，血液標本常常是通過人工或運輸系統(tǒng)送到臨床實驗室。在運輸過程中，血液標本受到不同的氣壓、加速、減速和振動的影響，細胞因子水平可能發(fā)生變化。本研究通過左右反復搖擺模擬強力處理導致輕度溶血，然后檢測血漿IL-6、IL-10、IFN和IL-2水平，結果顯示，保存前和強力處理或反復凍融后細胞因子水平變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在實際工作中，有些冰凍的標本可能需要再次檢測，研究結果顯示，當血漿標本經(jīng)過3次凍融后，IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2水平是相對穩(wěn)定的。

全血采集后應盡快離心成血漿，并在冷藏下保存，如果在室溫下保存，血液標本應在抽取后6 h內進行處理；如果在4 ℃下保存，血液標本應在抽取后24 h內進行處理。