尿流式細(xì)胞術(shù)、MALDI-TOF MS及VITEK 2 XL全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)聯(lián)合試驗(yàn)對(duì)尿培養(yǎng)標(biāo)本的藥敏鑒定結(jié)果評(píng)價(jià)

張 肖，楊鴻林，蔡 輝，沈 昊，顧 兵

1.蘇州市第九醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州 215200；2.江蘇盛澤醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州 215200；3.廣東省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510080

尿路感染是臨床常見(jiàn)的感染性疾病。近年來(lái)，細(xì)菌耐藥情況日趨嚴(yán)重，泌尿系統(tǒng)病原菌的耐藥機(jī)制各不相同。為了解住院患者尿路感染病原菌的耐藥情況，更好地實(shí)現(xiàn)尿培養(yǎng)標(biāo)本的快速報(bào)告，快速提供抗菌藥物選擇依據(jù)，本研究利用VITEK 2 XL對(duì)住院患者中段尿培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)鑒定與藥敏試驗(yàn)，并對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行尿流式細(xì)胞術(shù)菌量計(jì)數(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)直接鑒定。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2021年1-10月蘇州市第九醫(yī)院住院的296例泌尿系統(tǒng)感染患者送檢的清潔中段尿培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 全自動(dòng)接種儀(法國(guó)生物梅里埃公司);VITEK 2 XL全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司)；MALDI-TOF MS儀及配套試劑(德國(guó)布魯克道爾頓公司)；UF-1000i尿流式細(xì)胞儀及配套試劑(希森美康有限公司)；血瓊脂平板(鄭州安圖生物技術(shù)公司)。

1.3方法

1.3.1尿液標(biāo)本采集、保存及處理 標(biāo)本采集按照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[1]留取尿液。采集方法包括：清潔中段尿采集、恥骨上膀胱穿刺采集、留置導(dǎo)尿管采集、膀胱導(dǎo)尿采集、嬰幼兒尿液采集袋采集及其他不常用的尿液采集方法(如回腸導(dǎo)管導(dǎo)尿采集、間歇性導(dǎo)尿管采集、腎盂造瘺術(shù)、輸尿管造口術(shù)、膀胱鏡檢查術(shù)采集等)。中段尿標(biāo)本2 h內(nèi)進(jìn)行接種，否則應(yīng)置于4～8 ℃冰箱保存，時(shí)間不得超過(guò)8 h。

1.3.2常規(guī)鑒定與藥敏試驗(yàn) 使用全自動(dòng)接種儀定量(10 μL)清潔中段尿接種于血平板，于35 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育18～24 h。經(jīng)次代培養(yǎng)后取平板上的菌落(一種病原菌)，根據(jù)革蘭染色情況，用0.45%無(wú)菌氯化鈉溶液調(diào)節(jié)菌懸液至0.50～0.63麥?zhǔn)蠞岫?MCF)。革蘭陽(yáng)性菌采用移液器吸取280 μL菌懸液加入3.0 mL 0.45%無(wú)菌氯化鈉溶液中做藥敏試驗(yàn)，分別在兩試管放鑒定卡(GP)和藥敏卡(GP-67)；革蘭陰性桿菌采用移液器吸取145 μL菌懸液加入3.0 mL 0.45%無(wú)菌氯化鈉溶液中做藥敏試驗(yàn)，分別于3試管放鑒定卡(GN)、藥敏卡(GN-67和XN-04)，放入VITEK 2 XL全自動(dòng)鑒定藥敏儀充液和上機(jī)，6～8 h后記錄儀器檢測(cè)結(jié)果。

1.3.3直接鑒定(MALDI-TOF MS直接鑒定法)[2]采用UF-1000i尿流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)尿液中的菌量，選擇中段尿菌量計(jì)數(shù)>105個(gè)/毫升的標(biāo)本(一種病原菌)。取收集的清潔中段尿標(biāo)本1.0 mL于1.5 mL EP管中，2 000×g離心30 s去除細(xì)胞，取上清液于15 500×g離心5 min收集細(xì)菌，取沉渣用無(wú)菌生理鹽水500 μL清洗1次，自然干燥，加5 μL 70%甲酸及5 μL 100%乙腈，混勻，取沉淀物1 μL點(diǎn)靶，室溫干燥后加1 μL基質(zhì)[α-氰基4-羥基肉桂酸(HCCA)]覆蓋，待干燥后用MALDI-TOF MS技術(shù)進(jìn)行鑒定。由MALDI-TOF MS鑒定分值來(lái)確定結(jié)果的可靠性。

1.3.4鑒定結(jié)果評(píng)定 MALDI-TOF MS的鑒定分值≥2.0時(shí)，表示鑒定到種，結(jié)果可信；鑒定分值在1.7～<2.0時(shí)，表示鑒定到屬；鑒定分值<1.7時(shí)，表示鑒定結(jié)果不可信。

1.3.5直接藥敏試驗(yàn) 使用UF-1000i尿流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)尿液中的菌量，將中段尿菌量計(jì)數(shù)>105個(gè)/毫升的標(biāo)本按100～300、500～1 100、500～1 500、1 300～1 900、1 700～1 900個(gè)/微升進(jìn)行稀釋，采用VITEK 2 XL全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行直接藥敏試驗(yàn)，分析結(jié)果。

1.3.6常規(guī)藥敏試驗(yàn) 尿培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本轉(zhuǎn)種培養(yǎng)獲得純菌落后，根據(jù)細(xì)菌的菌落形態(tài)及革蘭染色情況，分別將革蘭陽(yáng)性球菌懸液稀釋后加入至GP-67藥敏卡，將革蘭陰性桿菌懸液稀釋后加入至GN-67和XN-04，并使用VITEK 2 XL系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[最低抑菌濃度(MIC)法]，具體方法見(jiàn)廠家提供的藥敏試驗(yàn)操作程序。藥敏試驗(yàn)最終以美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的微量肉湯藥敏手工法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)準(zhǔn)確性評(píng)估。

1.3.7判斷標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)控菌株 按照CLSI 《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)則進(jìn)行判斷，符合率為實(shí)驗(yàn)方法與常規(guī)方法的結(jié)果一致性。非常重大錯(cuò)誤：直接藥敏為敏感(S)而常規(guī)藥敏為耐藥(R)。重大錯(cuò)誤：直接藥敏為R而常規(guī)藥敏為S。微小錯(cuò)誤：直接藥敏為R或S而常規(guī)藥敏為中介(I)，直接藥敏為I而常規(guī)藥敏為R或S。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC13883、銅綠假單胞ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923、糞腸球菌ATCC29212。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用世界衛(wèi)生組織細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)推薦的WHONET5.6軟件及SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1VITEK 2 XL鑒定法與MALDI-TOF MS技術(shù)直接鑒定法結(jié)果對(duì)比 在MALDI-TOF MS直接法鑒定結(jié)果中，鑒定到種水平的有278例(93.9%)，鑒定到屬水平的289例(97.6%)，沒(méi)有提供可靠鑒定結(jié)果的7例(2.3%)。次代培養(yǎng)后VITEK 2 XL鑒定結(jié)果符合率為100.0%。兩種鑒定法的鑒定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 VITEK 2 XL鑒定法與MALDI-TOF MS鑒定法結(jié)果對(duì)比

2.2直接藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果與常規(guī)藥敏結(jié)果對(duì)比

2.2.1革蘭陰性菌 菌量計(jì)數(shù)100～300個(gè)/微升與常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果的總符合率、非常重大誤差率、重大誤差率和微小誤差率分別為99.1%(2 650/2 674)、0.3%(8/2 674)、0.2%(6/2 674)和0.4%(10/2 674)；菌量計(jì)數(shù)500～1 100個(gè)/微升與常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果的總符合率99.9%(2 670/2 674)，微小誤差0.1%(4/2 674)，未發(fā)生非常重大誤差和重大誤差；菌量計(jì)數(shù)1 300～1 900個(gè)/微升與常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果的總符合率98.9%(2 644/2 674)，1例無(wú)結(jié)果[0.03%(1/2 674)]，重大誤差0.4%(12/2 674)，微小誤差0.6%(17/2 674)。由于CLSI關(guān)于腸桿菌科、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌的藥物種類判斷標(biāo)準(zhǔn)不一致，所以不同抗菌藥物細(xì)菌藥敏總數(shù)不完全一致。分析不同種屬革蘭陰性菌的藥敏結(jié)果，腸桿菌目和非發(fā)酵菌屬直接藥敏試驗(yàn)結(jié)果中亞胺培南、美羅培南、慶大霉素和左旋氧氟沙星在3種菌量計(jì)數(shù)區(qū)間未出現(xiàn)誤差，其藥敏結(jié)果非常可靠。

2.2.2革蘭陽(yáng)性菌 菌量計(jì)數(shù)100～300個(gè)/微升與常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果的總符合率、非常重大誤差率、重大誤差率和微小誤差率分別為98.7%(1 174/1 190)、0.3%(3/1 190)、0.9%(11/1 190)和0.2%(2/1 190)；菌量計(jì)數(shù)500～1 500個(gè)/微升與常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果的總符合率99.7%(1 187/1 190)，微小誤差0.3%(3/1 190)，未發(fā)生非常重大誤差和重大誤差；菌量計(jì)數(shù)1 300～1 900個(gè)/微升與常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果的總符合率99.2%(1 180/1 190)，重大誤差0.08%(1/1 190)，微小誤差0.7%(8/1 190)。由于CLSI關(guān)于葡萄球菌屬、腸球菌屬和鏈球菌屬的藥物種類判斷標(biāo)準(zhǔn)不一致，所以不同抗菌藥物細(xì)菌藥敏總數(shù)不是完全一致。葡萄球菌屬、腸球菌屬和鏈球菌屬直接藥敏試驗(yàn)結(jié)果中克林霉素、高濃度慶大霉素、高濃度鏈霉素和四環(huán)素在3種菌量計(jì)數(shù)區(qū)間未出現(xiàn)誤差，結(jié)果可靠。

3 討 論

常規(guī)方法對(duì)尿培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)通常需要2～3 d才能出具報(bào)告，歷時(shí)較長(zhǎng)。本研究評(píng)估了UF-1000i與MALDI-TOF MS技術(shù)的聯(lián)合直接分析中段尿培養(yǎng)標(biāo)本中病原菌的效果，該方法減少了病原菌鑒定的時(shí)間，再加上直接藥敏試驗(yàn)，將結(jié)果報(bào)告時(shí)間至少可提前24 h，有利于臨床及時(shí)選擇有效的抗菌藥物，避免經(jīng)驗(yàn)用藥。

目前，尿培養(yǎng)陽(yáng)性的MALDI-TOF MS技術(shù)直接鑒定與儀器法直接藥敏試驗(yàn)的研究并不多。2018年本課題組研究發(fā)現(xiàn)，UF-1000i進(jìn)行尿菌量計(jì)數(shù)>105個(gè)/毫升采用MALDI-TOF MS直接鑒定結(jié)果可靠[2]。在此次試驗(yàn)鑒定結(jié)果中，MALDI-TOF MS沒(méi)有提供可靠鑒定結(jié)果的占2.3%，原因可能是存在一些影響因素，差速離心法并不能完全保證病原菌與細(xì)胞和雜蛋白等徹底分離，帶有雜質(zhì)的標(biāo)本懸液可能造成質(zhì)譜分值降低，鑒定不出或菌種錯(cuò)判[3]。目前臨床引起尿路感染的病原菌相對(duì)比較單一，以大腸埃希菌為主，而采用MALDI-TOF MS技術(shù)快速鑒定尿標(biāo)本中病原菌時(shí)大腸埃希菌鑒定率高達(dá)92.0%，體現(xiàn)了較高的臨床應(yīng)用價(jià)值[4]。此外，可通過(guò)增加差速離心次數(shù)和甲酸乙腈萃取步驟，結(jié)合尿流式細(xì)胞術(shù)(有形成分中亞硝酸鹽、白細(xì)胞酯酶、細(xì)菌)等其他輔助手段來(lái)提高鑒定率，以實(shí)現(xiàn)MALDI-TOF MS技術(shù)快速鑒定。

本研究結(jié)果顯示，革蘭陰性菌的MALDI-TOF MS技術(shù)快速鑒定中，鑒定到屬的檢出率為100.0%，鑒定到種的檢出率為95.3%；革蘭陽(yáng)性菌鑒定到屬的檢出率為95.2%，鑒定到種的檢出率為89.5%。根據(jù)革蘭陰性菌繁殖速度的生長(zhǎng)特點(diǎn)，雖然基本條件是尿菌量計(jì)數(shù)>105個(gè)/毫升，但研究發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌的菌量計(jì)數(shù)顯著高于革蘭陽(yáng)性菌，鑒定效果較革蘭陽(yáng)性菌為好[5]。本研究中，兩種鑒定方法的鑒定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但直接鑒定在時(shí)間上較傳統(tǒng)鑒定法快至少24 h，有明顯優(yōu)勢(shì)。另外，隨著MALDI-TOF MS的快速鑒定應(yīng)用越來(lái)越廣泛，有學(xué)者提出“短期培養(yǎng)法”，4～6 h后采集菌膜并用MALDI-TOF MS直接檢測(cè)，準(zhǔn)確率可得到明顯提高[6]。早期研究有學(xué)者報(bào)道可通過(guò)紙片法(K-B)做直接藥敏試驗(yàn)，但近年研究顯示，可以通過(guò)MALDI-TOF MS技術(shù)檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌及其表型，以及快速檢測(cè)泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌等[7-8]。

本研究在MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果基礎(chǔ)上，對(duì)296例泌尿系統(tǒng)感染患者尿培養(yǎng)常見(jiàn)細(xì)菌直接進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。革蘭陰性桿菌菌量計(jì)數(shù)500～1 100個(gè)/微升時(shí)有4株出現(xiàn)微小誤差，此革蘭陰性桿菌計(jì)數(shù)水平的尿液最合適做直接藥敏試驗(yàn)。分析不同種屬細(xì)菌的藥敏結(jié)果顯示，腸桿菌目和非發(fā)酵菌屬直接藥敏試驗(yàn)結(jié)果中亞胺培南、美羅培南、慶大霉素和左旋氧氟沙星在3種菌量計(jì)數(shù)區(qū)間未出現(xiàn)誤差，其藥敏結(jié)果非常可靠。在菌量計(jì)數(shù)100～300個(gè)/微升出現(xiàn)8株非常重大誤差，原因可能為尿液菌量計(jì)數(shù)較少，并未達(dá)到儀器檢測(cè)的菌懸液濃度，也有可能為尿中的蛋白細(xì)胞等影響了儀器的檢測(cè)，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)誤差。而在菌量計(jì)數(shù)1 300～1 900個(gè)/微升中出現(xiàn)12株重大錯(cuò)誤，可能由于尿液菌量計(jì)數(shù)量較多，尿液中雜質(zhì)和細(xì)胞較多，過(guò)于渾濁，導(dǎo)致結(jié)果不可靠。革蘭陽(yáng)性球菌菌量計(jì)數(shù)100～300個(gè)/微升出現(xiàn)11株非常重大誤差，原因?yàn)閮x器法藥敏試驗(yàn)中革蘭陽(yáng)性菌較革蘭陰性菌需要的菌量計(jì)數(shù)量更大，當(dāng)菌量計(jì)數(shù)量少時(shí)，革蘭陽(yáng)性菌的誤差更大。革蘭陽(yáng)性菌的菌量計(jì)數(shù)500～1 500個(gè)/微升與常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果的總符合率為99.7%，微小誤差為0.3%，未發(fā)生非常重大誤差和重大誤差，為革蘭陽(yáng)性球菌最合適的尿液直接藥敏試驗(yàn)的菌量計(jì)數(shù)。葡萄球菌屬、腸球菌屬和鏈球菌屬直接藥敏試驗(yàn)結(jié)果中克林霉素、高濃度慶大霉素、高濃度鏈霉素和四環(huán)素在3種菌量計(jì)數(shù)區(qū)間未出現(xiàn)誤差，結(jié)果可靠。本研究發(fā)現(xiàn)，直接藥敏試驗(yàn)中的菌量計(jì)數(shù)會(huì)影響直接藥敏試驗(yàn)結(jié)果，其改進(jìn)措施為可以對(duì)中段尿進(jìn)行差速離心，去除雜質(zhì)和細(xì)胞，并稀釋至相應(yīng)的濃度。

本研究結(jié)合尿流式細(xì)胞術(shù)和MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果對(duì)尿培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中常見(jiàn)細(xì)菌直接進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其結(jié)果與常規(guī)藥敏試驗(yàn)高度相符。本研究發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性桿菌為泌尿系統(tǒng)感染的主要病原菌，當(dāng)菌量計(jì)數(shù)500～1 100個(gè)/微升可以進(jìn)行直接藥敏試驗(yàn)，這對(duì)提高泌尿系統(tǒng)感染患者減少細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生和減輕醫(yī)療費(fèi)用有重要意義；而革蘭陽(yáng)性菌雖然有最適計(jì)數(shù)，但革蘭陽(yáng)性菌的菌量計(jì)數(shù)普遍偏小，所以為了減少誤差，必須進(jìn)行培養(yǎng)后再做藥敏試驗(yàn)，以免造成錯(cuò)誤結(jié)果，誤導(dǎo)臨床治療。