長鏈非編碼RNA對肺結核的診斷效能Meta分析*

鄭緒香，施紹瑞，汪順偉，余 燕，楊學強，廖 婧，解學龍，聶 濱

宜賓市第二人民醫院檢驗科，四川宜賓 644000

結核病是由結核分枝桿菌引起的以呼吸道感染為主的重大慢性傳染性疾病,分為肺內結核和肺外結核，肺結核根據痰涂片是否能檢出結核分枝桿菌，分為活動性肺結核和非活動性肺結核。據世界衛生組織(WHO)統計數據報告，在全球范圍內，結核病是導致死亡的十大原因之一，也是傳染病致死的主要原因。2019年全球新發結核病患者約996萬，其中我國2019年新發結核病患者約為83.3萬，結核病發病率約為58/10萬(2018年約為61/10萬)[1]。結核病確診依賴病原學診斷，培養是病原學診斷的金標準，但該方法由于培養時間長，通常為5～8周，以至于很難及時診斷及治療[2]。因此，探索一種高靈敏度、高特異度，且可廣泛使用的診斷方法及標志物具有重要臨床意義。

長鏈非編碼 RNA(lncRNA)是一類不編碼蛋白質、長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，占非編碼RNA的80%～90%，并廣泛參與機體內幾乎所有的生理、病理過程，能夠在表觀遺傳、基因的轉錄和轉錄后，以及基因翻譯等多個層面上發揮調控作用[3]，并參與機體相關免疫調控[4]。有研究顯示，lncRNA可穩定存在機體外周血中，其表達水平可用于疾病的早期診斷和預后評價，其中循環lncRNA與結核病的發生、發展有密切聯系，可作為診斷結核病的潛在生物標志物[5-6]。但目前對lncRNA診斷的準確性尚無統一結論。因此，本文采用 Meta 分析方法系統評價lncRNA 對結核病的診斷效能。

1 資料與方法

1.1資料來源 檢索 PubMed、Web of Science、Embase、SinoMed、The Cochrane Library、中國知網、萬方、維普數據庫，搜索關于lncRNA在肺結核研究中的相關文獻，檢索時間從建庫至2021年1月。中文檢索詞包括：肺結核、結核、結核病、結核分支桿菌、長鏈非編碼RNA、長鏈非編碼rna等。英文檢索詞包括：tuberculosis、Tuberculoses、Kochs Disease、Mycobacterium tuberculosis Infection、Long Noncoding RNA、lncRNA、Long ncRNA等。

1.2文獻納入及排除標準 納入標準：(1)公開發表的有關lncRNA方法診斷肺結核的準確性的橫斷面研究、隊列研究、隨機對照試驗等，不限定研究類型，發表時間為建庫至2021年1月，語言為英文和中文；(2)研究對象為臨床確診的肺結核患者；(3)標本來源為外周血或血清；(5)文獻明確闡明是研究循環lncRNA與結核病診斷的關系，并能完整提取四格表數據，包括真陽性、假陽性、真陰性、假陰性。排除標準：(1)重復發表文獻；(2)研究對象為細胞系基礎研究或動物實驗等；(3)標本來源為組織或其他體液的lncRNA；(4)綜述、病例報告、會議記錄、評論性文獻等；(5)無法獲取全文、缺乏原始數據或其他關鍵信息。

1.3文獻篩選和資料提取 由2名研究人員通過閱讀文獻摘要、文獻全文，根據納入和排除標準，確定納入研究文獻，然后進行數據提取。如有異議，通過討論或與第3位研究者討論共同確定。根據文獻研究，需要提取內容包括：第一作者、發表年限、國家、標本類型、研究人群、病例組及對照組數量、lncRNA類型、靈敏度、特異度、受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)。

1.4文獻質量評價 納入研究文獻后，使用Revman5.0診斷試驗質量評價工具(QUADAS)-2[7]進行質量評價，包括病例選擇、待評價診斷試驗、金標準試驗、研究流程和進展情況4個項目。偏移風險評價中對每項研究中的問題判斷為“是、否或不清楚”；“是”表示偏倚風險低，“否”表示偏倚風險高，“不清楚”表示信息不足[8]。對文獻臨床適用性采用“低風險、高風險、不清楚”進行評價。

1.5統計學處理 通過Meta-disc軟件計算納入研究之間的Spearman相關系數(r)，判斷是否存在閾值效應，P>0.05說明不存在閾值效應。若無閾值效應則通過對診斷數據的進行合并分析，判斷其診斷價值；若存在閾值效應，僅通過繪制集成ROC(SROC)曲線并計算AUC來判斷診斷價值。使用Stata15.0進行統計學分析，采用雙變量混合效應模型[9](“midas”程序包)對靈敏度、特異度等進行合并統計分析。所有結果均以合并值和95%CI表示。通過Q檢驗結合I2判斷統計學異質性大小，當P<0.05或I2≤50%，說明納入研究間異質性較小；當P>0.05或I2>50%，說明納入研究間異質性較顯著，需進一步分析異質性來源[10]。可根據標本類型、病例組樣本量大小、發表年限等進行Meta回歸和亞組分析,當P<0.05證明是導致異質性來源。使用Stata15.0制作Deeks漏斗圖評價文獻發表偏移，當P>0.1表示無發表偏移，P<0.1提示存在發表偏移。

2 結 果

2.1文獻篩選流程及結果 初篩共納入329篇，最終納入12篇文獻[11-22]。其中包括4篇英文文獻，8篇中文文獻。

2.2納入研究的基本特征及質量學評價 本研究共計納入12篇文獻累計1 145例患者和1 585例對照者。文獻發表年限為2017-2020年，其中關于活動性肺結核研究為7篇[11,13-15,20-22](共計有活動性肺結核16個比較組)；6篇為肺結核研究組[12,15-19](共計7個比較組)，患者為符合肺結核診斷標準患者，未標明進一步結核感染分類。納入文獻基本特征見表1。利用QUADAS-2對文獻進行質量評價,由于研究中文獻均采用病例-對照研究，因此導致病例選擇均為“高風險”，但仍屬于研究范疇。在活動性肺結核及肺結核未分類組中的診斷標準各異，未設定閾值，所以在待評價診斷試驗中多數為“不清楚”。在診斷標準，研究流程及進展情況中多數為“低風險”。臨床適用性方面，兩組納入文獻在均為“低風險”較多。

表1 納入研究基本特征

2.3Meta分析結果

2.3.1lncRNA診斷肺結核的準確性及靈敏度分析 lncRNA合并診斷活動性肺結核中，Spearman相關系數r=-0.087(P=0.749>0.05)，結果顯示活動性肺結核組無閾值效應。采用雙變量混合效應模型進行合并計算，結果顯示lncRNA合并診斷靈敏度為0.75(95%CI：0.67～0.82)，特異度為0.87(95%CI：0.80～0.91)，陽性似然比為5.61(95%CI：3.62～8.70)，陰性似然比為0.28(95%CI：0.21～0.39)，見表2。SROC 曲線 AUC 為0.88(95%CI：0.85～0.91)。僅診斷為肺結核組中，Spearman相關系數r=0.918(P=0.004<0.05)，表明肺結核(未分類)存在閾值效應，lncRNA診斷結果使用SROC曲線的AUC表示，AUC為0.80(95%CI：0.76～0.83)。將肺結核組(未分類)與活動性肺結核組結果使用Stata15.0進行靈敏度分析，剔除可能導致異質性文獻后，重新進行Meta分析，結果顯示靈敏度和特異度均未見明顯變化，表明本研究結果較穩定，結果可信度高。

表2 lncRNA合并診斷活動性肺結核靈敏度、特異度及似然比

2.3.2Meta回歸分析及亞組分析 活動性肺結核組I2檢驗結果顯示：靈敏度、特異度中I2檢驗結果分別為90.54%、94.87%(均>50%)，Q檢驗結果顯示P<0.05,因此活動性肺結核組異質性較大，需進一步探討其非閾值效應的異質性來源。對標本類型、病例組樣本量大小、發表年限及標本類型進行Meta回歸分析，通過單變量Meta回歸分析結果顯示，納入異質性可能來源于病例組納入樣本量大小、標本類型、RNA提取方法(P<0.05)；亞組分析結果顯示，小樣本量組的AUC高于大樣本量組，RNA提取方法亦可能是造成異質性的原因，對文獻結果有一定的影響。見表3。

2.3.3發表偏移 使用Stata15.0制作Deeks漏斗圖，結果顯示活動性肺結核組存在發表偏移(P<0.1)，而未分類肺結核組不存在發表偏移(P>0.1)。見圖1。

表3 lncRNA診斷活動性肺結核亞組分析

續表3 lncRNA診斷活動性肺結核亞組分析

注：A為活動性肺結核組發表偏移，研究點1～16分別為陳敏等-1[11]、陳敏等-2[11]、羅杰-1[13]、羅杰-2[13]、羅杰-3[13]、羅杰-4[13]、楊曉帆-1[14]、楊曉帆-2[14]、楊曉帆-3[14]、趙繼利-4[15]、羅清[22]、宋佳佳等-1[21]、房雅倫-1[20]、房雅倫-2[20]、房雅倫-3[20]、房雅倫-4[20]的研究；B為肺結核組發表偏移，1～7分別為SUN等[16]、HU等[17]、CHEN等[18]、SUN等[19]、胡玉婷-4[12]、趙繼利-1[15]、趙繼利-3[15]的研究。

3 討 論

目前結核病篩查及診斷的方法有涂片染色、培養、結核菌素試驗(TST)、T細胞酶聯免疫斑點法(T-SPOT)、γ干擾素釋放試驗(IGRA)等。在活動性肺結核階段，痰涂片及痰培養能較好發現病原菌，但陽性率均較低[24]，且該階段患者已屬結核病的中晚期。這些常用方法在早期診斷中作用甚微。結核的早發現、早診斷、早治療有利于降低患者感染率、病死率。因此尋找一種操作簡潔，靈敏度、特異度高的快速檢測方法及標志物顯得尤為重要。

lncRNA占所有非編碼RNA的80%，其特點之一是其細胞水平低于編碼蛋白質的RNA，且具有較高的組織特異性[25]。歐葉青等[26]發現，lncRNA在潛伏性結核感染患者血漿中有1 485個lncRNA差異表達，其中上調819個，下調666個。而羅杰等[13]研究表明，lnc-FAM110B、lnc-GUCY2C-1、NEAT1、MALAT1 4個標志物聯合應用區分健康對照組和活動性肺結核組的AUC達0.87。lncRNA在活動性肺結核、潛伏性肺結核及耐多藥肺結核中均有差異表達，并有較高診斷價值，然而目前尚無統一標準。

本文回顧目前發表的關于lncRNA在肺結核方面的臨床研究，探討lncRNA在活動性肺結核及肺結核未分類患者中的診斷價值。通過Spearman相關系數判斷在活動性肺結核組中不存在閾值效應(P>0.05)，使用Stata15.0合并靈敏度等結果顯示，lncRNA在活動性肺結核中有較高的靈敏度和特異度，合并陽性似然比為5.61(95%CI：3.62～8.70)，說明活動性肺結核患者檢出陽性結果是非患者的5.61倍。合并陰性似然比為0.28(95%CI：0.21～0.39)，說明活動性肺結核患者陰性結果是非結核患者的0.28倍。SROC 曲線的AUC 為0.88(95%CI：0.85～0.91)，該結果顯示lncRNA對于活動性肺結核診斷具有較好的診斷價值。I2檢驗結果顯示，在活動性肺結核組納入的文獻中有較高的異質性，進行回歸和亞組分析后，亞組分析結果顯示異質性來源為標本量大小及lncRNA提取方法，Meta分析結果顯示當病例數<40時，診斷價值更高，因此在未來研究中，應提高病例組人數，并且根據研究要求選擇合適的RNA提取方法，避免過低或過高的估計lncRNA在活動性肺結核中的診斷價值。Meta分析結果顯示，因診斷為肺結核組中Spearman系數結果顯示存在閾值效應(P<0.05)，通過SROC 曲線計算 AUC 為0.80(95%CI：0.76～0.83),結果顯示lncRNA在肺結核未分類組中，具有較好的診斷價值。活動性肺結核組漏斗圖提示具有一定的偏移性，分析原因可能有：(1)文獻中大多為小樣本研究；(2)文獻異質性太大可能對發表偏移有一定的影響。肺結核組中不存在文獻發表偏移。

本篇文獻存在一定局限性：文獻中主要檢索了中文和英文文獻，可能存在語言偏移；文獻的研究地區均為中國地區，可能代表性不高；在篩選出的文獻中，均為病例-對照研究，未能遵循盲法試驗，可能對文獻質量評價以及對研究結果造成偏移。

綜上所述，lncRNA用于活動性肺結核及肺結核患者的診斷具有較好診斷價值，且lncRNA在活動性肺結核中有較高的靈敏度和特異度，但其臨床價值仍需大量的高質量研究來驗證。