不同流式微球分析法多重細胞因子檢測試劑對比與分析*

高麗麗，趙仁彬，王婭婕，李增政，撒亞蓮，楊同華△

昆明理工大學附屬醫院/云南省第一人民醫院/云南省血液疾病臨床醫學中心/云南省血液病醫院：1.血液科；2.臨床醫學中心,云南昆明 650032

細胞因子是由免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導多種細胞合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白或多肽，可分為白細胞介素(IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、趨化因子和生長因子等，其同機體的免疫細胞和免疫器官構成人體復雜的網絡關系,并作用于靶細胞后介導各種疾病的保護性或破壞性免疫應答[1-2]。正常生理狀態下，人體內細胞因子的水平是不可檢測或是非常低的。但在病理狀態下，細胞因子會出現異常表達。因此，對細胞因子的檢測有助于判斷機體的免疫功能，指導治療，評估患者的療效與預后。

雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是檢測細胞因子最經典的一種方法，但由于所需標本量較大，靈敏度低，穩定性差，操作起來耗時耗力，效率低，缺乏多重性，一次只能檢測一種細胞因子，已不能滿足臨床所需。而流式微球分析法所需標本量少，且一次檢測可快速實現多個目標蛋白的定性和定量檢測，能反應細胞因子之間的網絡關系，體現出免疫動態演變關系。有研究顯示，流式微球分析法和ELISA的結果具有很好的一致性，且流式微球分析法具有更高的特異度和靈敏度，對于小體積標本的適用性良好，可廣泛適用于臨床研究及實驗室進行高通量細胞因子檢測[3-4]。本實驗中所用的3種試劑盒都是基于流式微球技術研發而成，不同的是各試劑盒的具體驗操作步驟和檢測的細胞因子組合。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2021年12月在云南省第一人民醫院(下稱本院)確診為急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、噬血細胞綜合征(HPS)和多發性骨髓瘤(MM)的50例患者(病例組)分別作為ALL組、AML組、CML組、HPS組和MM組，每組10例。病例組男28例、女22例，年齡27～65歲。ALL、AML、CML、HPS和MM的診斷及分型標準分別參照2016版《中國成人急性淋巴細胞白血病診斷與治療指南》[5]、2017版《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細胞白血病)中國診療指南》[6]、2016版《中國慢性髓性白血病診斷與治療指南》[7]、2018版《噬血細胞綜合征診治中國專家共識》[8]、2018版《多發性骨髓瘤診治指南解讀》[9]。另選取同期健康體檢者12例作為健康組，其中男5例、女7例，年齡25～60歲。本研究經本院倫理委員會批準，所有受試者簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 NovoCyte 2060R流式細胞儀[艾森生物(杭州)有限公司]；A試劑(天津礦博同生生物技術有限公司)；B試劑(青島瑞思凱爾生物科技有限公司)；C試劑(江西諾德醫療器械有限公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集及處理 采集各組受試者入院或體檢時外周血3～5 mL，注入真空分離膠促凝管，室溫自然凝固，離心5 min，取上層血清500 μL備用，標本收集后于4～6 h內檢測，如無法及時檢測，收集后立即-20 ℃保存，長期保存l置于-80 ℃條件下，忌反復凍融。血清標本的處理過程嚴格按照各試劑盒說明書操作。采用3種不同試劑(A、B、C試劑)檢測健康組血清標本6種細胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ)水平，并用篩選后試劑檢測6組血清標本14種細胞因子(IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12P70、IL-1β、IL-2、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-17A、IL-17F、IL-22)水平。

1.3.2檢測數據獲取及分析 標本上機前行流式細胞儀質控檢測分析，檢查各參數的測試數據是否在標準范圍內，以此確保儀器的穩定可靠運行；完成實驗后收集數據，使用回歸系數來擬合標準曲線，檢測結果參照標準曲線得出精確水平，輸出數據文件，A試劑和C試劑的數據分析軟件為BD FCAP Array v3.0.1，B試劑的數據分析軟件為其自帶的分析軟件。

2 結 果

2.1健康組6種細胞因子檢測結果比較 采用A、B、C試劑分別檢測健康組6種細胞因子水平，檢測結果見表1。A試劑的檢測值范圍寬，高、低值差異明顯，C試劑和 B試劑的檢測值低，且較集中。C試劑和A試劑對IL-6、IL-10、IFN-γ的檢測結果比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；A試劑和B試劑對IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ的檢測結果比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；C試劑和B試劑對IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 6種細胞因子的檢測結果比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2健康組6種細胞因子的變異系數(CV) A、B、C試劑檢測結果的CV見表2，A試劑檢測結果的CV比較均一。

表1 A、B、C試劑分別對健康組6種細胞因子檢測結果比較

表2 A、B、C試劑分別檢測6種細胞因子的CV

2.3A試劑檢測各組14種細胞因子水平 篩選的A試劑對各組14種細胞因子的檢測結果顯示，ALL組、AML組、CML組和MM組IL-8檢測結果明顯高于正常參考值，HPS組IL-10檢測結果明顯高于正常參考值，差異均有統計學意義(P<0.05)。健康組血清標本的檢測結果在A試劑正常參考值或正常參考值上限的3倍以內，病例組5組患者的檢測結果覆蓋范圍寬。篩選的A試劑能很好地區分健康組與病例組標本。見表3。

表3 A試劑對各組14種細胞因子的檢測結果比較

組別nIL-1βIL-2IFN-γTNF-αTNF-βIL-17AIL-17FIL-22健康組121.91±0.153.32±1.052.29±0.631.94±0.592.26±0.631.26±0.113.60±1.102.14±0.53ALL組101.83±0.304.54±0.883.36±0.753.20±0.703.61±0.403.22±0.343.92±1.271.62±0.43AML組102.20±0.2318.40±6.073.56±1.064.19±1.073.47±1.144.25±1.114.63±1.032.65±0.83CML組102.68±0.265.56±1.583.55±1.033.55±1.133.99±1.122.59±0.712.24±0.542.04±0.65HPS組101.77±0.393.85±1.223.75±1.152.98±0.563.61±1.122.40±0.542.64±0.320.98±0.25MM組102.06±0.785.56±1.383.52±0.773.03±0.263.88±0.682.66±0.334.66±1.072.17±0.63

3 討 論

流式微球技術是一種僅需少量標本即可快速完成多種可溶性蛋白成分的定性和定量檢測的分析技術，是集微球技術、ELISA和流式細胞術等優點于一身的液相蛋白檢測技術，具有高通量、高靈敏度、重復性好、成本低等諸多優點[10]。流式微球技術的原理是將一系列帶有不同熒光強度、包被有捕獲抗體的不同大小的微球作為載體，特異性捕獲液相標本中相應的抗原，再結合生物素檢測抗體，形成雙抗體夾心結構，以流式細胞術作為檢測平臺，探測不同熒光信號的強度達到對待測標本抗原定性和定量的目的[11]。

因各試劑盒中使用的微球、抗體及孵育時間不同，細胞因子的檢測結果有所差異[12]。不僅如此，標本的留取及處理、標準品的稀釋倍數、標曲的擬合、儀器設備的條件及數據分析，每個步驟若操作不當均可影響檢測結果。在標本的留取及處理過程中需著重注意以下3點：(1)首先要確保標本的合格，若標本發生溶血，血細胞碎片、血紅蛋白等均會影響細胞因子與微球的結合。通過多次洗滌細胞及標本上機前將流式細胞儀調至最佳狀態可以有效去除血清中的雜質[13]。此外，細胞因子標本的留取采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血獲取，并于收集后0 ℃立即離心，或暫存于4 ℃條件下4 h內離心分離出血漿的標本是最好的[14]。(2)標本與微球結合的過程中若混勻的不夠充分，會造成微球成團，導致細胞因子分群異常，影響結果的分析[13]。(3)當標本中待測指標的水平過低時會出現檢測值不在標準曲線上，以致沒有檢測結果。低靈敏度主要是由標準曲線的設計而引起的，通過增加標準曲線的低水平標準點或重新制作標準曲線可以解決此問題[13，15-16]。

本實驗室中3種試劑的標本處理及標準品的制備各有不同。標本處理：C試劑和B試劑標本孵育均在流式管中進行，C試劑標本孵育一步完成，B試劑標本孵育分兩步完成，孵育過程中未持續振蕩混勻，單槍加樣，效率低，洗滌后需離心去上清，容易致微球損失。A試劑標本孵育分三步完成，使用96孔濾膜板，排槍加樣，孵育過程中持續振蕩混勻，每完成一步都通過真空泵抽濾反復洗滌細胞，微球不易丟失，整個操作過程方便快捷，極大地降低了人力、物力和時間成本。標準品的制備：C試劑2倍倍比稀釋，覆蓋范圍較窄，較低濃度的細胞因子不易檢出；A試劑3倍倍比稀釋，覆蓋范圍更寬，低值更靈敏，同時兼顧中高值；B試劑4倍倍比稀釋，跨度過大，CV、重復性差。可見標準品的稀釋倍數不同可致每組檢測敏感區間有所差異。通過對比三者的實驗操作過程及檢測結果，A試劑相對于C試劑和B試劑有更多的優勢所在，更適用于臨床。在多項研究中，A試劑也體現了其可用性[17-19]。

總之，細胞因子的準確檢測對于診斷和評估不同的疾病狀態至關重要。優化細胞因子檢測試劑盒的設計和提高實驗人員的操作水平，可提高細胞因子結果的準確性，有利于指導臨床診療。