基于網絡藥理學及分子對接技術探討半夏瀉心湯治療胃食管反流病的作用機制*

羅安，胡佳

江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330006

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是一種食管動力障礙性疾病[1]，以燒心和反流為主要臨床表現，其不典型癥狀包括胸痛、上腹部燒灼感、咽中梗阻感等，臨床上常常容易被誤診漏診。一項Meta分析指出，我國部分社區人群胃食管反流病的患病率為7.69%[2]，但由于現代社會生活節奏和飲食結構的變化，中國GERD的發生率正逐漸增高。當前，西醫治療GERD主要以質子泵抑制劑(proton pump inhibitor，PPI)或鉀離子競爭性酸阻滯劑(potassium-competitive acid blocker，P-CAB)為主，同時還有促胃動力藥、H2受體拮抗劑以及外科手術治療等[3-5]，但是長期服用PPI有很多不良反應[6-7]。中醫藥在提高GERD療效、減少不良反應以及降低患者的經濟負擔上有明顯優勢[8-10]。

GERD在古代并無中醫病名，根據其癥狀可歸屬“吐酸”“食管癉”“嘈雜”等范疇[11]，半夏瀉心湯是《傷寒論》中的經典名方，由半夏、大棗、甘草、干姜、黃芩、黃連、人參等7味中藥組成。方中半夏既能降逆和胃，又能散結消痞，故為君藥；黃芩、黃連苦寒降胃，干姜溫中散寒，三者合為臣藥；人參、大棗既能防黃芩、黃連苦寒傷陽，又能制約半夏、干姜之辛熱，共為佐藥；甘草補中健脾，調和諸藥為使藥，全方配伍寒熱并用，辛苦并進，補瀉兼施，是治療寒熱錯雜型胃食管反流病的代表方[12]。現代藥理學研究表明，半夏瀉心湯在臨床上治療消化系統疾病十分廣泛，療效顯著，能夠保護胃黏膜[13]，在治療GERD時發揮抗炎、促食管動力等作用[14-17]。本研究基于中藥及復方多成分、多靶點、多通路的作用特點，采用網絡藥理學和分子對接探究半夏瀉心湯治療胃食管反流病的分子作用機制，為后續的臨床實踐提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 半夏瀉心湯組方中藥活性成分及相關靶點的獲取基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)分別以半夏瀉心湯組方中藥半夏、大棗、甘草、干姜、黃芩、黃連、人參為檢索詞進行檢索，獲得其化學成分，根據口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為標準篩選獲得半夏瀉心湯組方中藥活性成分及其對應的CID號，并通過PubChem數據庫利用CID號檢索出相對應活性成分的Canonical SMILES碼。將活性成分的Canonical SMILES碼輸入Swiss Target Prediction數據庫(https：//www.swisstargetprediction.ch/)，設置物種為“Homo sapiens”，篩選出每個活性成分的相關作用靶點及其對應的標準基因名稱，將所有標準基因名稱匯總，刪除重復項，即得到半夏瀉心湯組方中藥活性成分相關靶點。

1.2 GERD相關靶點的獲取在DisGeNET數據庫(https：//www.disgenet.org/search)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//www.omim.org/)和GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org/)中以“gastroesophageal reflux disease”為關鍵詞進行檢索，匯總得到的疾病基因名稱，刪除重復項后獲得疾病相關靶點。

1.3 半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點的獲取將半夏瀉心湯組方中藥活性成分相關靶點與GERD疾病靶點導入韋恩圖繪制平臺(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)進行映射，取交集并將交集結果導出，即為半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點。

1.4 “半夏瀉心湯-活性成分-靶點”網絡的構建將半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點與所有中藥活性成分相關靶點的基因名稱進行匹對，將匹對結果匯編成txt文件導入Cytoscape 3.9.0軟件構建“半夏瀉心湯-活性成分-靶點”網絡并進行拓撲分析，篩選半夏瀉心湯治療GERD的核心活性成分。

1.5 構建蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡及篩選關鍵靶點將半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點導入STRING數據庫(https：//www.string-db.org/)，將物種設置為“Homo sapiens”，得到PPI網絡，下載txt文件，處理后導入Cytoscape3.9.0軟件，通過軟件中的CytoNCA插件對網絡進行拓撲分析，根據度中心性(degree centrality，DC)將分析結果前10%的關鍵節點導出，再將其重新導入STRING數據庫得到關鍵靶點的PPI網絡，拓撲分析篩選出半夏瀉心湯治療GERD的核心靶點。

1.6 關鍵靶點的基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析將關鍵靶點導入DAVID數據庫(http：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp)，選擇OFFICIAL_GENE_SYMBOL，列表類型選擇Gene List，進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。設定P值<0.01，并根據P值進行排序，通過微生信繪圖平臺(www.bioinformatics.com.cn/)對GO功能富集分析的前20條結果和KEGG信號通路富集分析的前10條結果進行繪圖。

1.7 分子對接驗證將“半夏瀉心湯-活性成分-靶點”網絡中度值排名靠前且OB值、DL值遠高于標準值的活性成分與關鍵靶點PPI網絡中度值排名靠前的靶點進行對接，通過pubchem數據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載活性成分2D結構，通過PDB數據庫(https：//www.rcsb.org)獲取靶點蛋白3D結構，利用Chem 3D對活性成分進行優化，并在PyMOL軟件中刪除蛋白受體的水分子，運用Autodock Vina和Pymol將活性成分受體和靶點蛋白配體進行對接及優化制圖。

2 結果

2.1 半夏瀉心湯組方中藥活性成分及相關靶點基于TCMSP分別以半夏瀉心湯方中半夏、大棗、甘草、干姜、黃芩、黃連、人參為檢索詞進行檢索，以OB≥30%且DL≥0.18為標準進行篩選，刪除無對應CID號和Canonical SMILES碼的成分，獲得半夏瀉心湯組方中藥活性成分，其中半夏11個、大棗17個、甘草64個、干姜3個、黃連13個、黃芩29個、人參17個，刪除重復成分后得到活性成分140個，部分活性成分見表1。將140個活性成分的Canonical SMILES碼輸入Swiss Target Prediction數據庫，刪除重復項后得到1 111個藥物靶點。

2.2 GERD疾病相關靶點在DisGeNET數據庫、OMIM數據庫和GeneCards數據庫中以“gastroesophageal reflux disease”為關鍵詞進行檢索，刪除重復項后獲得4 176個疾病相關靶點。

2.3 半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點將1 111個半夏瀉心湯組方中藥活性成分相關靶點與4 176個GERD疾病靶點導入韋恩圖繪制平臺(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)進行映射，得到412個交集靶點，即為半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點，見圖1。

表1 半夏瀉心湯組方中藥部分活性成分相關信息

圖1 半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點韋恩圖

2.4 “半夏瀉心湯-活性成分-靶點”網絡的構建將半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點與所有中藥活性成分相關靶點進行匹對，將成分與靶點映射匯編成txt文件，將文件導入Cytoscape3.9.0軟件構建“半夏瀉心湯-活性成分-靶點”網絡發現，該網絡共涉及553個節點和 5 115 條邊，網絡拓撲分析計算化合物的度值(degree)，列出度值排名前10位的化合物，結合表1可以看出槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、黃芩素(baicalein)、山柰酚(kaempferol)、豆甾醇(stigmasterol)、表小檗堿(epiberberine)是幾味中藥的共有成分，且OB值及DL值遠高于篩選標準值，推測，槲皮素、β-谷甾醇、黃芩素、山柰酚、豆甾醇、表小檗堿等是半夏瀉心湯治療GERD的核心活性成分。見圖2、表2。

圖2 “半夏瀉心湯-活性成分-靶點”網絡圖

表2 “半夏瀉心湯-活性成分-靶點”網絡度值排名前10位的化合物信息表

2.5 PPI網絡及關鍵靶點將篩選得到的412個潛在靶點導入STRING數據庫進行PPI網絡分析，將分析后的數據導入Cytoscape3.9.0軟件，通過軟件中的CytoNCA插件進行拓撲分析，根據度中心性將分析結果前10%的關鍵節點導出，得到42個關鍵靶點，再將其重新導入STRING數據庫得到關鍵靶點的PPI網絡，通過度值賦予靶點顏色，度值越大則靶點顏色越深，由此推測靠近圓中心的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、熱休克蛋白90AA1(heat shock proteins 90AA1，HSP90AA1)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、缺氧誘導因子1亞基α(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF1α)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等為半夏瀉心湯治療GERD的核心靶點。見圖3。

圖3 關鍵靶點PPI網絡圖

2.6 GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析GO功能富集分析包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞組分(cellular component，CC)3個方面，將42個靶點導入DAVID數據庫進行GO功能富集分析共得到515個BP條目、63個CC條目及93個MF條目，其中BP主要與基因表達的正/負向調控(positive/negative regulation of gene expression)、細胞因子介導的信號通路(cytokine-mediated signaling pathway)等過程相關；CC主要涉及大分子復合物(macromolecular complexe)、細胞質(cytoplasm)、胞質溶膠(cytosol)等；MF主要涉及酶結合(enzyme binding)、蛋白質結合(protein binding)、蛋白激酶結合(protein kinase binding)等功能。設置P<0.01，根據P值排序后，選取排名前20的條目繪制條形圖，見圖4。對42個關鍵靶點進行KEGG信號通路富集分析篩選得到150條信號通路，主要涉及腫瘤相關通路(pathways in cancer)、腫瘤中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、人類巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)等通路，推測半夏瀉心湯可能通過以上通路發揮治療胃食管反流病的作用。設置P<0.01，根據P值排序后選取排名前10位的條目繪制氣泡圖，見圖5。

圖4 關鍵靶點GO功能富集分析

圖5 關鍵靶點KEGG信號通路富集分析

2.7 分子對接驗證一般認為，結合能越小，受體與配體之間的活性越強，穩定性越高。將篩選得到的核心活性成分β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素同時與關鍵靶點HIF1α、HSP90AA1、STAT3、TP53進行“多對一”分子對接，結果顯示，核心成分β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素與關鍵靶點HIF1α、HSP90AA1、STAT3、TP53結合能均小于-7 kcal·mol-1，結合穩定。見表3，圖6。

表3 半夏瀉心湯核心成分與關鍵靶點結合能 (kcal·mol-1)

注：紅色代表槲皮素；青色代表β-谷甾醇；紫色代表豆甾醇；黃色虛線代表氫鍵

3 討論

GERD是由胃酸、胃蛋白酶、膽汁等反流至食管并損傷食管黏膜產生的炎癥反應，其發病機制十分復雜，炎癥因子是其中一個重要的因素。GERD患者食管活檢樣本檢測發現，IL-6和IL-8等炎性因子參與胃食管反流病的發生[18]。阿布拉江·米吉提等[19]指出不僅是白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子和部分趨化因子，自由基同樣也參與了GERD患者食管黏膜的損傷，且自由基水平越高，損傷程度越嚴重。

β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素是半夏瀉心湯組方中藥中幾種中藥的共同成分，且OB值、DL值較篩選標準值高，度值大，故認為這三者為半夏瀉心湯治療GERD的核心活性成分。β-谷甾醇具有多種藥理作用，其作用之一就是抗炎。β-谷甾醇可明顯減少胸膜滲出量及中性粒細胞[20]。Liao等[21]研究發現，β-谷甾醇可通過降低細胞中TNF-α、IL-6和IL-8的水平抑制巨噬細胞中NF-κB信號通路的激活，從而減少炎癥的發生和細胞損傷。豆甾醇是一種植物甾醇，可顯著抑制LPS誘導的 COX-2 升高，COX-2高表達能加重食管組織損傷[22]。李建軍[23]發現98例GERD患者食管組織標本中 COX-2 的表達水平增高，尤其以巴雷特食管表達最高，且隨著血清中炎性因子的表達水平增高而增高。研究表明，反流性食管炎患者的食管黏膜 COX-2 表達水平明顯高于正常食管黏膜[24]，證實高表達COX-2能夠加重食管黏膜損傷，導致GERD發生。槲皮素作為一種黃酮類化合物，具有抗感染等作用[25-28]。周霄楠等[29]通過構建LSP誘導RAW264.7細胞炎癥模型發現，槲皮素能夠明顯抑制TNF-α、IL-6等釋放從而起到抗炎作用。

本研究發現半夏瀉心湯治療胃食管反流病的作用機制可能是通過參與基因表達的調控、凋亡過程的調控、細胞因子介導的信號通路等生物過程，調節酶結合、轉錄因子結合、染色質結合等分子功能，主要參與腫瘤信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等信號通路。分子對接結果表明，β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素與關鍵靶點HIF1α、HSP90AA1、STAT3、TP53的對接結合能均<-7 kcal·mol-1，結合穩定，初步驗證半夏瀉心湯中β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素等核心成分可作用于HIF1α、HSP90AA1、STAT3、TP53等關鍵靶點，通過參與相關通路來治療GERD。STAT3在腫瘤及其微環境扮演十分重要角色[30-31]，研究發現，炎癥因子IL-6通過激活STAT3通路導致食管腺癌的形成[32]。HIF1α名為缺氧誘導因子-1的α亞單位，與炎癥反應密切相關[33]，趙東梅等[34]將40例RE患者均分為對照組和治療組，分別給予PPI和PPI+中藥治療后發現，血清HIF1α表達水平均下降。孫穎等[35]研究發現，GERD患者體內HIF1α呈高表達狀態，這與趙冬梅的研究結果基本相符。半夏瀉心湯參與腫瘤通路，抑制相關STAT3通路的激活，減少炎癥因子的釋放，保護食管黏膜細胞，從而達到治療GERD的目的。

本研究運用網絡藥理學和分子對接技術探討半夏瀉心湯治療GERD的作用機制發現，半夏瀉心湯可通過多成分、多靶點、多通路治療GERD，但是本研究未結合相關實驗驗證其作用機制，具有一定的局限性，后續會進一步深入研究。