益生菌對慢性阻塞性肺疾病大鼠腸道菌群和炎癥反應的影響*

程友靜，張蕓蕓，廖世霞

（1.遵義醫科大學第二附屬醫院 體檢科，貴州 遵義 563006；2.遵義醫科大學附屬醫院呼吸一科，貴州 遵義 563000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是一種慢性進展性的肺病理異質性疾病，其特征為持續性氣流阻塞、氣道炎癥增加和肺組織破壞[1]。COPD 的發病率和病死率較高，已成為世界公共衛生問題[2]。目前，COPD 的治療方法有限，主要是肺移植[3]、吸入氫氣[4]、皮質類固醇和支氣管擴張劑[5]，存在治療成本較高，免疫排斥和部分患者療效欠佳等缺點。因此，尋找新型有效的治療COPD 的藥物已成為臨床亟待解決的問題。

腸道菌群失調不僅降低胃腸道免疫反應，還會影響肝、肺等遠端器官的免疫，進而危害身體健康。近年來，大量研究證實腸道菌群與呼吸系統疾病密切相關，尤其是哮喘、COPD、肺癌和呼吸道感染等[6-8]。此外，亦有學者指出益生菌治療可調整慢性乙肝患者腸道菌群結構，改善肝功能[9]。然而，目前關于益生菌治療COPD 的研究相對較少。僅有研究報道，短雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌可抑制吸煙誘導的人巨噬細胞中的炎癥反應[10]，以及口服補充鼠李糖乳桿菌可減輕COPD 小鼠的肺泡損傷和氣道炎癥[11]。因此，本研究通過煙霧刺激和脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）灌胃復制COPD 大鼠模型，探討益生菌對COPD 大鼠腸道菌群變化、炎癥反應和肺損傷的影響，以期為臨床防治COPD 提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

30 只Wister 雄性大鼠，（80±3）天齡，體重200～250 g，購自重慶市陸軍軍醫大學實驗動物中心。實驗動物生產許可證號：SCXK（渝）2007-0005，實驗動物使用許可證號：SYXK（黔）2021-0003。

Probiotic IMM（美國Pure Encapsulations 公司，批號：6030112A），紅旗渠?過濾嘴香煙（河南中煙工業有限責任公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色試劑盒、C 反應蛋白（C-reactive protein,CRP）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0105S、PC188、PT516），Masson 三色染色試劑盒、白細胞介素8（Interleukin-8，IL-8）ELISA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1340、SEKR-0071），α 平滑肌肌動蛋白（α smooth muscle actin,α-SMA）抗體（美國Cell Signaling 公司，批號：19245），Alexa Fluor?488 山羊抗大鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）（H+L）、Alexa Fluor?555 山羊抗大鼠IgG（H+L）熒光標記二抗和Hoechst 33258（美 國Thermo Fisher公司，批 號：A11006、A21434、H3569）。

1.2 動物分組和COPD模型的復制

將30 只大鼠隨機分為對照組、COPD 組和治療組，每組10 只。COPD 組和治療組參考文獻[12]復制COPD 大鼠模型：第1 天和第14天，大鼠氣道注射200 μL LPS 溶液；第2～13 天和第15～30天，將大鼠置于熏蒸箱并暴露于香煙煙霧中（煙霧濃度約為18%（υ/υ），暴露時長為20 min/次，2 次/d，間隔4 h）。對照組大鼠注射等量生理鹽水，不予熏蒸。

采用等效劑量系數折算法計算出益生菌Probiotic IMM 的給藥劑量為0.9 CFU/g/（kg·d）。按此劑量，治療組大鼠灌胃1 次/d，持續28 d；對照組和COPD 組大鼠灌胃等量生理鹽水。

1.3 方法

1.3.1 觀察大鼠一般情況每天上午9:00 定時觀察各組大鼠一般情況，包括飲食量、活動表現、氣喘咳嗽癥狀、毛發光澤度和死亡等。

1.3.2 HE 染色觀察大鼠肺組織病理變化腹腔注射4%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉各組大鼠。75%乙醇消毒后打開大鼠胸腔，剝離出完整的肺。將各組大鼠肺葉組織用4%多聚甲醛緩沖液固定過夜，脫水，石蠟包埋，制成4 μm 厚的切片。加蘇木精和伊紅染色，脫水，風干，封片，在光鏡下觀察各組大鼠肺組織病理變化。

1.3.3 Masson染色觀察大鼠肺組織纖維化改變將載有4 μm 厚組織切片的載玻片置于65℃烘箱中烘干1 h，然后脫蠟。經蘇木精和Masson 麗春紅酸性復合液染色，將玻片放入1%磷鉬酸水溶液中分化3 min，亮綠染色5 min，脫水封片，光鏡下觀察肺組織纖維化改變。

1.3.4 免疫熒光雙染觀察大鼠肺組織α-SMA 的表達分離獲取大鼠肺組織，加4% 多聚甲醛固定，加0.3% Triton X-100封閉30 min。加入α-SMA 一抗（1∶200 稀釋），4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS）清洗5次，加入山羊抗大鼠熒光標記二抗混合物（1∶1 000 稀釋），37℃避光反應30 min，加入Hoechst 33258 孵育15 min，甘油封閉，在激光共聚焦顯微鏡下觀察α-SMA 的表達。

1.3.5 ELISA 檢測血清CRP、IL-8、TNF-α 水平大鼠腹主動脈取血，收集血液于采集管中，3 000 r/min離心12 min 得到血清。根據ELISA 試劑盒說明書，將血清樣本加入96 孔板，分別加入抗大鼠CRP、IL-8 和TNF-α，室溫下孵育30 min。PBS 清洗后，依次加過氧化物酶標記的生物素化二抗、TMB 和TMB 終止液。最后用酶標儀測量各樣本在450 nm 處的光密度（optical density,OD）值，并根據標準曲線計算對應樣品濃度。

1.3.6 腸道菌群預配置腸球菌Enter 培養基、腸桿菌EMB 培養基、乳酸桿菌LBS 培養基和雙歧桿菌BS 培養基。收集各組大鼠新鮮糞便（1∶10～1∶1 000 000 000 稀釋），吸取10 μL 標本接種于培養基上，每個稀釋度接種3次，并選取合適的稀釋度計算菌落均值（CFU/g）。

1.4 統計學方法

數據分析采用GraphPad Prism 8.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，比較t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

對照組大鼠飲食正常，動作迅捷，反應靈敏，皮毛順滑。COPD 組大鼠在模型復制過程中及模型復制成功后都出現異常表現，如食欲不振，食量減少，呼吸急促，咳嗽頻繁，毛發枯黃雜亂，反應遲緩等。進一步灌胃益生菌，治療組大鼠癥狀有所減輕。其中，COPD 組和治療組在模型復制過程中各死亡2只、1 只大鼠，對照組大鼠無死亡。

2.2 各組大鼠肺組織病理變化

對照組大鼠細支氣管管腔結構和肺泡組織形態正常，無炎癥細胞浸潤。COPD 組大鼠細支氣管管壁和基底層增厚，管腔狹窄變形甚至閉塞，其周圍有大量炎癥細胞浸潤；上皮細胞紊亂增生，肺泡壁變薄，且部分肺泡破裂。但治療組Probiotic IMM 灌胃后，大鼠肺組織形態得到明顯改善，炎癥浸潤和管腔增厚等癥狀有所減輕，破損肺泡數量減少。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織（HE染色×400）

2.3 各組大鼠肺組織纖維化改變

對照組大鼠肺組織主要為紅色肌纖維，而藍色膠原纖維幾乎不可見。COPD 組大鼠肺組織藍染膠原纖維較對照組顯著增加，提示膠原沉積增多，肺組織發生嚴重纖維化。治療組Probiotic IMM 灌胃后，大鼠肺組織膠原纖維沉積明顯減少，纖維增生得到抑制。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織（Masson染色×400）

2.4 各組大鼠肺組織α-SMA的表達

COPD 組大鼠肺支氣管平滑肌α-SMA 陽性表達較對照組明顯增加，但治療組肺支氣管平滑肌α-SMA 陽性表達較COPD 組有所減少。見圖3。

圖3 各組大鼠肺組織α-SMA的表達（免疫熒光雙染×400）

2.5 各組大鼠血清CRP、IL-8和TNF-α水平比較

對照組、COPD 組、治療組大鼠血清CRP、IL-8和TNF-α 水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=3 533.340、327.033 和2 338.562，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：COPD 組和治療組大鼠血清CRP、IL-8 和TNF-α 水平高于對照組（P＜0.05）；而治療組大鼠血清CRP、IL-8 和TNF-α 水平低于COPD 組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清CRP、IL-8和TNF-α水平比較（n=10，pg/mL，）

表1 各組大鼠血清CRP、IL-8和TNF-α水平比較（n=10，pg/mL，）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與COPD組比較，P ＜0.05。

2.6 各組大鼠腸道菌群比較

對照組、COPD 組、治療組大鼠腸球菌、腸桿菌含量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=97.180 和225.778，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：COPD 組和治療組腸球菌、腸桿菌含量高于對照組（P＜0.05）；治療組腸球菌、腸桿菌含量低于COPD 組（P＜0.05）。見表2。

對照組、COPD 組、治療組大鼠乳酸桿菌、雙歧桿菌含量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=104.602 和114.833，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：COPD 組乳酸桿菌、雙歧桿菌含量低于對照組（P＜0.05）；而治療組乳酸桿菌、雙歧桿菌含量高于COPD 組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腸道菌群比較（n=10，CFU/g，）

表2 各組大鼠腸道菌群比較（n=10，CFU/g，）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與COPD組比較，P ＜0.05。

3 討論

“腸-肺”軸是指胃腸道和肺的共同黏膜免疫系統[13]，腸道和肺之間以及腸道菌群和宿主免疫之間存在復雜而重要的交互作用，暗示腸道菌群在調節慢性呼吸道疾病炎癥中發揮至關重要的作用[14]。既往研究證實，腸道微生物失調不僅參與調節宿主對呼吸道感染的免疫反應[6]，而且促進哮喘、COPD、肺癌和呼吸道感染等呼吸道疾病的發生、發展，加重COPD 病程，增加COPD 患者胃腸道紊亂的發生率，如克羅恩病和潰瘍性結腸炎[15]。因此，腸道微生態的改變可作為評估COPD 發病程度的生物學指標[16]。

COPD 作為一種常見的慢性肺疾病，致病因素包括吸入香煙煙霧或其他有毒顆粒、慢性哮喘、職業性接觸粉塵，主要特征為長期炎癥、肺組織破壞和氣流阻塞導致的肺功能下降[17]。本研究發現，COPD 組大鼠肺組織出現嚴重損傷，光鏡下可見細支氣管管壁增厚，膠原沉積增多，纖維增生，管腔狹窄變形且部分堵塞，肺泡壁變薄乃至破裂，存在大量炎癥細胞浸潤。而治療組大鼠肺組織炎癥浸潤、膠原纖維沉積和管腔增厚等癥狀明顯減輕，提示肺損傷有所好轉。α-SMA 作為平滑肌細胞收縮的基礎結構，可被轉化生長因子β1刺激誘導，促進膠原沉積和纖維化形成，進而加重氣道重塑[18]。本研究發現，COPD 組大鼠肺支氣管α-SMA 陽性表達較對照組明顯增加，但治療組肺支氣管α-SMA 陽性表達有所減少，提示益生菌治療可改善COPD 大鼠肺損傷，減少膠原沉積，減輕氣道重塑。

穩定期COPD 患者的糞便微生物組和代謝組均與健康人群有顯著差異，其優勢菌株主要為雙歧桿菌科、真桿菌科、乳酸菌科、微球菌科、鏈球菌科和細絨毛桿菌科等[19]。本研究采用選擇性培養基進行傳統細菌培養，檢測各組大鼠腸道菌群中條件致病菌腸球菌、腸桿菌，以及腸道共生菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的含量。結果發現，COPD 組大鼠腸道中腸球菌和腸桿菌含量較對照組大幅提升，但乳酸桿菌和雙歧桿菌含量明顯下降。此時，致病菌作為優勢菌過度生長，引起菌群失調。相較于COPD組，治療組大鼠腸道中腸球菌和腸桿菌含量有所降低，伴隨著乳酸桿菌和雙歧桿菌含量增加。即口服益生菌可有效改善COPD 大鼠的腸道菌群構成，降低條件致病菌豐度，并增加腸道共生菌含量，使之更接近于正常大鼠腸道微生態。腸道微生物群參與機體飲食成分的發酵，分解產生短鏈脂肪酸和氨基酸等。而這些微生物代謝產物可被腸黏膜組織吸收，與肺受體結合并激活免疫細胞[20]。

腸道微生態失衡導致呼吸道疾病惡化，致病菌產生的代謝物激發免疫細胞，通過淋巴和循環系統作用于肺黏膜，引起肺免疫反應失衡。JOSEFOWICZ等[21]在CNS1-小鼠胃腸道內發現了輔助型T 細胞2 型炎癥，炎癥因子水平升高，且Foxp3（+）調節性T 細胞也被激活。由于血清CRP、IL-8和TNF-α水平隨著病情加重而呈上升趨勢，故以上指標的聯合檢測對評估COPD 患者病情嚴重程度有較高的臨床價值[22-23]。本研究發現，COPD組大鼠血清CRP、IL-8和TNF-α水平較對照組明顯升高，表明機體免疫反應被激活。治療組大鼠血清CRP、IL-8 和TNF-α 水平較COPD 組顯著下調，即口服益生菌抑制COPD 大鼠炎癥反應。雖然本課題檢測了相關炎癥因子水平以反映機體炎癥程度，但參與調控該進程的潛在信號分子和機制尚待進一步研究。

綜上所述，益生菌可有效改善COPD 大鼠肺損傷和腸道菌群結構，減輕炎癥反應和氣道重塑。