銅綠假單胞菌T3SS和T6SS的基因分布特性及與耐藥的相關性

周蓓蓓，王凌波，張秀彩，陳櫟江，王忠永，周鐵麗

1.溫州醫科大學附屬第一醫院 醫學檢驗中心 浙江省檢驗診斷及轉化研究重點實驗室，浙江 溫州 325015；2.浙江大學醫學院附屬兒童醫院 實驗檢驗中心，浙江 杭州 310052

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種能引起多部位感染的人類常見機會致病菌，可以導致肺部、尿路、燒傷創面和糖尿病足等多種感染[1]。研究顯示，由銅綠假單胞菌導致的感染在院內感染中呈不斷上升的趨勢，且多重耐藥銅綠假單胞菌日益增加，限制了抗菌藥物的治療選擇[2-3]。 銅綠假單胞菌具有多種促進感染發生發展的毒力因素，其中分泌系統是重要的毒力因素之一，細菌可以通過分泌系統獲取營養成分，向外界環境分泌毒素蛋白，或者直接作用于真核生物的作用靶點發揮致病性[4]。較多研究表明[5-6]，III型分泌系統（type III secretion system, T3SS）在臨床上常與嚴重感染相關，銅綠假單胞菌可通過T3SS將分泌蛋白注入宿主細胞；VI型分泌系統（type VI secretion system, T6SS）是銅綠假單胞菌的另一分泌系統，可編碼3個T6SS分泌系統（H1-、H2-和H3-T6SS）[7]。目前有較多國內外報道對臨床菌株T3SS毒力因子的流行和作用進行探究，但T6SS毒力因子的流行情況及特性仍未完全明確，并且最近發現的T6SS效應蛋白PldA、PldB具有較強的毒力效應，不僅可以競爭殺菌還可內化至非吞噬細胞[8]，因此對于T6SS相關因子攜帶率的檢測和探究極為重要。另外BOULANT等[9]發現T3SS及T6SS相關因子在引起人類不同感染的銅綠假單胞菌中的攜帶具有一定的差異，而呼吸道和血液作為銅綠假單胞菌分離的兩大標本來源，探究T3SS和T6SS效應基因與不同標本來源菌株之間的關系具有一定的臨床意義。

細菌耐藥性和毒力特征是影響銅綠假單胞菌感染臨床預后的關鍵因素，隨著多重耐藥銅綠假單胞菌在臨床中的快速出現，迫切需要新的方法來治療由銅綠假單胞菌引起的各種嚴重感染。毒力抑制策略是一種有潛力的策略，而了解臨床菌株中編碼毒力因子基因的分布情況是關鍵。本研究旨在通過檢測痰液及血液來源標本中T3SS和T6SS效應蛋白相關基因的分布特性，并分析其與細菌耐藥性的關系，為臨床控制銅綠假單胞菌所致感染以及藥物靶向治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集2016年至2018年間分離自溫州醫科大學附屬第一醫院住院患者痰液和血液標本的銅綠假單胞菌共92株（剔除同一患者相同來源的重復菌株），其中來源于痰液標本61株，血液標本31株。菌株分離：將血液樣本接種至血培養瓶中，血培養報陽后接種于血平板上，37 ℃培養18～24 h 后觀察菌落形態；將痰液標本接種于血平板、嗜血平板及科瑪嘉平板，37 ℃培養18～24 h后觀察菌落形態；將疑似菌落由基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）鑒定系統進行鑒定，確定為銅綠假單胞菌，菌株保存在30%甘油肉湯保菌管中，并存于-80 ℃超低溫冰箱中。本研究已獲得本院倫理委員會批準（倫理批號：KY2022-R139）。

1.2 儀器和試劑 VITEK MS質譜鑒定儀（法國生物梅里埃公司，VITEK MS PLUS）；PCR擴增儀（美國Thermo公司，VertiTMDx 96 Well Thermal Cycler）。Muller-Hintom（MH）瓊脂（英國OXOID有限公司）；細菌基因組提取試劑盒（北京BioFlux公司）；引物合成（上海華大生物科技有限公司）；PCR反應試劑（大連Takara公司）；凝膠成像分析系統（美國BIO-RAD公司）。

1.3 VITEK MS質譜鑒定儀菌株鑒定 將待測微生物與基質液進行混合加在靶板上，待干后形成樣本基質結晶體，經激光輻射使樣本的蛋白進入飛行時間檢測器，檢測器通過檢測蛋白飛行時間的不同來建立微生物蛋白質量指紋圖，進而與數據庫中的信息比對來對微生物種或菌株進行區分和鑒定。大腸埃希菌ATCC 8739作為實驗的校準菌株，鑒定可信度達到99.9%則證明鑒定正確。

1.4 聚合酶鏈反應（PCR） 參照細菌基因組提取試劑盒說明書方法提取基因組模板，使用特異性引物進行PCR擴增。PCR引物序列參照文獻[6-7]合成，引物序列見表1。在PCR擴增儀中設置反應條件如下：預變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 1 min；退火30 s（溫度視基因而不同，見表1）；延伸72 ℃ 1 min，35個循環；再延伸72 ℃ 5 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，GelRed染色后于凝膠成像系統觀察結果。所有PCR陽性擴增產物均送至上海華大基因科技有限公司進行測序確認。

表1 T3SS和T6SS效應蛋白基因引物序列

1.5 藥物敏感性試驗 采用瓊脂稀釋法檢測菌株對常用抗菌藥物亞胺培南、環丙沙星、頭孢他啶、阿米卡星的敏感性，結果判讀參照美國臨床和實驗室標準化協會（Clinical and Labortory Standards Institute, CLSI）2020年標準判斷[10]。

1.6 統計學處理方法 采用SPSS26.0統計軟件進行處理，計數資料以頻數和率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，利用Spearman相關系數分析部分菌株中T3SS和T6SS效應蛋白編碼基因之間的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同來源T3SS和T6SS效應蛋白基因檢測結果 92株臨床分離銅綠假單胞菌中T3SS效應蛋白編碼基因exoT及T6SS效應蛋白編碼基因tssB1、tse2、tssB2、pldB均高達90%以上；其中痰液標本來源菌株T3SS效應蛋白基因exoU的攜帶率顯著高于血液來源菌株（P＜0.05），而T3SS及T6SS其他相關效應蛋白基因的攜帶率在兩種不同的標本來源的菌株中差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 不同來源銅綠假單胞菌T3SS和T6SS效應蛋白基因攜帶率比較［株（%）］

2.2 不同來源的銅綠假單胞菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥率 痰液及血液來源菌株對臨床常用抗菌藥物亞胺培南、環丙沙星、頭孢他啶以及阿米卡星的耐藥情況比較結果顯示，痰液來源菌株對亞胺培南的耐藥率顯著高于血液來源菌株（49.2%vs.25.8%），差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同來源銅綠假單胞菌對常用抗菌藥物的耐藥率［株（%）］

2.3 T3SS和T6SS效應蛋白編碼基因的相關性分析exoU為T3SS的發揮致病作用的主要毒力因子，有文獻報道T6SS蛋白編碼基因pldA和T3SS蛋白編碼基因exoU的攜帶與非囊性纖維化患者預后惡化有一定的關聯[11]，為了檢測T6SS蛋白編碼基因是否與T3SS蛋白編碼基因的攜帶具有相關性，我們對毒力基因exoU和pldA進行了Spearman相關性分析，結果顯示pldA和exoU之間呈正相關（r=0.474，P＜0.01）。

2.4 T3SS和T6SS效應蛋白編碼基因與菌株耐藥性的關系 攜帶不同T3SS及T6SS基因的銅綠假單胞菌對亞胺培南、環丙沙星、頭孢他啶、阿米卡星的耐藥性分析結果顯示，與其他種類的抗菌藥物相比，攜帶T3SS和T6SS效應蛋白編碼基因的菌株對碳青霉烯類抗菌藥物亞胺培南具有較高的耐藥率；但攜帶不同T3SS及T6SS效應編碼基因的菌株對同類抗菌藥物的耐藥性差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4、表5。

表4 攜帶T3SS基因銅綠假單胞菌對常用抗菌藥物耐藥率比較［株（%）］

表5 攜帶T6SS基因銅綠假單胞菌對常用抗菌藥物耐藥率比較［株（%）］

3 討論

銅綠假單胞菌是一種引起社區和醫院獲得性感染的臨床常見條件致病菌[12-14]。銅綠假單胞菌可通過分泌系統分泌多種效應蛋白發揮毒性作用，其中T3SS是銅綠假單胞菌與外界環境交流的重要途徑之一[5-6]。張秀彩等[15]的研究顯示銅綠假單胞菌T3SS毒力基因exoT和exoY的攜帶率較高，毒力基因與銅綠假單胞菌耐藥性相關。T6SS是近年來發現的分泌系統，銅綠假單胞菌可通過T6SS向鄰近的病原體傳遞毒素和蛋白效應因子從而發揮其生存優勢，同時T6SS作為銅綠假單胞菌的毒力因子，還能促進其生物被膜的形成，對銅綠假單胞菌的致病性及耐藥性發揮重要作用[16]。了解T6SS各毒力因子編碼基因的流行分布特性，將有助于銅綠假單胞所致感染的控制。目前國內尚未見評估T6SS多個蛋白編碼基因流行率的相關報道。由痰液分離銅綠假單胞菌所引起的呼吸道感染常持續時間久較難清除，同樣由銅綠假單胞菌所引起血流感染的患者的治療具有一定的挑戰性，因此了解T3SS和T6SS效應基因與不同標本來源菌株之間的關系值得進一步探究。

本研究對92株銅綠假單胞菌臨床分離株中T3SS基因及T6SS基因的流行分布情況進行檢測分析，結果顯示T3SS效應蛋白編碼基因exoT以及T6SS效應蛋白編碼基因tssB1、tse2、tssB2、pldB的檢出率高達90%以上，表明這些基因在銅綠假單胞菌中具有普遍性，這與已有的研究報道[9，12]基本一致。另外本研究發現痰液標本來源菌株exoU的攜帶率顯著高于血液來源菌株（P＜0.05）。HORNA等[17]的研究指出T3SS效應蛋白編碼基因exoU是導致宿主細胞死亡的高度細胞毒性表型，攜帶exoU的菌株被認為具有較強的毒力且常與嚴重感染有關。而銅綠假單胞菌是引起呼吸道感染的重要原因，痰液是銅綠假單胞菌感染的主要標本分離來源，有研究報道[18]毒力強的銅綠假單胞菌更易引起呼吸道感染，這與本研究結果一致。可能與銅綠假單胞菌所引起的呼吸道感染持續時間長、預后較差有關。我們對2016至2018年不同標本來源銅綠假單胞菌的藥敏分析顯示痰液來源菌株對亞胺培南的耐藥率顯著高于血液來源菌株（P＜0.05），這可能因為呼吸道分離的銅綠假單胞菌的大部分患者常合并有肺部基礎疾病，導致對吸入微生物的清除延遲，治療周期長、易誘導和篩選出耐藥菌[19]。同時這提示我們在臨床用藥時要關注呼吸道來源銅綠假單胞菌的碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥水平，選擇合適藥物治療。另一方面有研究報道[8]銅綠假單胞菌中還存在3種進化上完全不同的T6SS基因群（分別為H1-T6SS、H2-T6SS和H3-T6SS），表達tse1、tse2、tse3、pldA、pldB等相關基因。其中由pldA基因編碼的磷脂酶A（PldA）是銅綠假單胞菌H2-T6SS的效應蛋白，可向宿主細胞傳遞毒素。本研究結果顯示包括pldA在內的T6SS相關效應蛋白編碼基因在痰液標本和血液標本來源的菌株中不存在顯著性差異。有研究報道指出黏液性銅綠假單胞菌中pldA和exoU的存在與非囊性纖維化患者惡化的高風險相關[11]，Spearman相關性分析結果顯示pldA和exoU表達之間呈正相關性（r=0.474，P＜0.01），這提示我們可對pldA在嚴重感染疾病中的致病作用開展進一步研究。關于T3SS和T6SS效應蛋白編碼基因與耐藥相關性的探究，之前有研究報道攜帶exoU基因的菌株耐藥性更強[20]。TAKATA等[21]的研究指出碳青霉烯類以及氟喹諾酮類耐藥菌株中exoU基因的攜帶率較高；另外BOULANT等[9]的研究也表明pldA基因在耐藥菌株中有較高的攜帶率。本研究結果顯示攜帶不同T3SS和T6SS基因銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗菌藥物亞胺培南的耐藥率較高，但不同的基因之間不具有顯著性差異（P＞0.05）。關于攜帶高毒力基因exoU或pldA或其他T3SS及T6SS相關基因菌株是否在介導抗菌藥物耐藥性方面起著相關作用仍需要在未來進行更加廣泛且深入的研究。

綜上所述，銅綠假單胞菌對T3SS和T6SS大部分效應蛋白編碼基因的攜帶情況具有一定普遍性，但個別毒力較高的分泌系統編碼基因的攜帶需要引起我們的關注。本研究提示T6SS或可作為治療銅綠假單胞菌感染性疾病的新靶標，從而針對性地控制T6SS相關效應蛋白編碼基因攜帶可能引起的銅綠假單胞菌相關感染疾病，另外在臨床治療中要及時關注痰液來源菌株的毒力特性及耐藥性，合理安排用藥方案。