亞甲基藍類似物抗谷氨酸誘導HT22細胞氧化損傷及其機制

陳紫微，陳秋荷，蔡瑜，侯姍姍，劉福和

1.浙江藥科職業大學 藥學院，浙江 寧波 315000；2.廣州中醫藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006

氧化應激（oxidative stress, OS）是指機體內產生的活性氧（reactive oxygen species, ROS）與機體抗氧化防御功能失衡。機體內過多的ROS通過氧化損傷多種重要的生物分子如脂質、DNA和蛋白質，進一步損害中樞神經系統功能[1]。目前研究認為多數老年相關的慢性疾病，如阿爾茨海默病 （Alzheimer’s disease, AD）、帕金森?。≒arkinson’s disease, PD）、亨廷頓病、肌萎縮性側索硬化癥、糖尿病、心血管病等都與機體內氧化應激損傷直接相關[2-3]。

亞甲基藍（methylene blue, MB）具有廣泛的生物活性、良好的藥代動力學性質及較低的毒性，被廣泛應用于醫學領域。目前，MB主要用于高鐵血紅蛋白血癥、瘧疾、環磷酰胺神經毒性等疾病的治 療[4]。MB類似物是一類與MB具有相似化學結構的化合物，基于廣泛的研究發現：MB類似物與MB相似，具有廣泛的生物活性，包括抗菌作用、抑制單胺氧化酶活性產生抗抑郁作用、抗氧化損傷作用等[4-8]。然而，目前關于MB結構類似物的抗氧化損傷及其機制研究鮮有報道，深入研究MB類似物的作用及其機制，并對其進行結構相關性分析，對該類相關藥物的研發、應用具有重要意義。本研究篩選出4種與MB結構類似的化合物：2-氯吩噻嗪（2-chlorophenothiazine,2-C）、天青A（azure A, A-A）、天青B（azure B, A-B）、中性紅（neutral red, NR），見圖1。通過毒性分析、抗氧化活性分析及機制研究，闡明以上4種化合物抗谷氨酸（glutamate, Glu）誘導的HT22細胞毒性作用及機制，并進一步分析化合物結構與活性的關系。

圖1 MB、NR、A-B、A-A及2-C的化學結構

肌細胞增強因子2（myocyte enhancer factor 2, MEF2）在機體生理和病理過程中發揮著重要作用。有研究表明，它們還與哺乳動物中樞神經系統的神經元存活、發育、分化和神經元可塑性密切相關[9]。 MEF2D是MEF2轉錄因子蛋白家族的成員，在調節神經系統的發育和功能方面發揮著關鍵作用[10]。SALMA等[11]研究發現抑制MEF2D活性可引起胚胎海馬神經元的凋亡。此外，研究發現OS可通過破壞MEF2D功能，參與多種神經退行性疾病的發生發 展[12-13]，如GAO等[14]研究表明：OS可通過氧化MEF2D使其失活，進一步誘導DA神經元死亡。因此，研究認為MEF2D可能成為抗OS損傷的重要作用靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：本研究所使用的細胞株為HT22細胞，來源于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.1.2 試劑：MB、2-C、A-B、A-A、NR購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胎牛血清，DMEM干粉由購自美國Gibco公司；H2DCF-DA、DMSO、Glu、MTT、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）檢測試劑盒購買于南京建成生物科技有限公司。T-糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase, GSK3β）、pSer9-GSK3β、pSer473-Akt、NADH脫氫酶6（NADH dehydrogenase, ND6）、TAkt一抗購自美國Santa Cruz公司（稀釋：1:500），MEF2D一抗購自美國BD Biosciences公司（稀釋：1:5 000），β-actin一抗購自美國Sigma-Aldrich公司（稀釋：1:10 000）；山羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司（稀釋：1:1 000），兔抗鼠二抗購自美國Promega公司（稀釋：1:10 000）。其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.1.3 儀器：恒溫震蕩箱（SHELLAB，美國），濾器（0.22 μm，Millipore，德國），多功能酶標儀工作站（Floxo，美國），細胞培養箱（Themo-fisher，美國），生物凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司），倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠），臺式低溫高速離心機（Eppendorf，德國），-80 ℃超低溫冰箱（Sanyo，日本），光學顯微鏡（Olympus，日本），酶標儀（BioTek，美國），垂直板蛋白電泳儀、電轉移（BioRad，美國），發光分子生物成影儀（Image Quant LAS 4000 mini，美國）。

1.2 方法

1.2.1 HT22細胞培養：從液氮罐中取出HT22細胞，迅速放置于37 ℃水浴鍋內復蘇，將細胞液轉移至15 mL離心管中，并加入3 mL 10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，混勻，隨后將離心管放入離心機 1 000 r/min離心5 min，離心后用移液槍小心吸去上層培養基，加入3 mL新鮮培養基，混勻，轉移至中皿，放置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養。當細胞密度達到90%時傳代。

1.2.2 建立細胞模型：HT22細胞是一種永生化的小鼠海馬神經元細胞系，其細胞缺少Glu受體[15]，因此該細胞暴露在高濃度Glu下能夠產生明顯的OS損傷。該模型是研究OS的一種經典模型。通過前期實驗研究和相關文獻檢索，采用2 mmol/L的Glu處理HT22細胞24 h，造成氧化損傷細胞模型。

1.2.3 MTT法檢測化合物對HT22細胞毒性：當HT22細胞處于對數生長期時進行實驗，使用胰酶將細胞消化，離心，棄去舊培養基，加入適量新培養基，調整細胞密度，吸取100 μL細胞液于96孔板中使細胞密度達到1×104/孔。培養24 h棄去舊培養基加入各濃度化合物100 μL，使各化合物濃度分別為 1 μmol/L、3 μmol/L、10 μmol/L，以加DMSO為對照組（CT組）。24 h后，加入10 μL MTT試劑，置于孵箱中孵育2 h；吸去上清液，每孔加入DMSO 100 μL， 置于孵箱，孵育15 min。在多功能酶標儀測定各個孔在570 nm處的吸光度。細胞存活率計算公式： （OD樣品-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100%?；衔锇霐抵滤懒浚╩edian lethal dose, LD50）檢測時各個化合物濃度分別為0.3 μmol/L、1 μmol/L、 3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L、1 mmol/L；以含相同濃度DMSO為對照組，其余操作與MTT檢測相同。

1.2.4 MTT法檢測化合物對Glu誘導HT22細胞損傷的保護作用：當HT22細胞處于對數生長期時進行實驗，使用胰酶將細胞消化、離心，棄去舊培養基，加入適量新培養基，調整細胞密度，吸取100 μL細胞液于96孔板中使細胞密度達到1×104/孔。培養24 h 棄去舊培養基加入各濃度MB及其類似物100 μL，使各化合物濃度分別為30 nmol/L、100 nmol/L、 300 nmol/L，上述藥物孵育30 min后，均加入終濃度為2 mmol/L的Glu。同時設置DMSO對照組（CT組）及Glu組，每組6個復孔，孵育12 h后，每孔加入10 μL 的MTT儲備液，于37 ℃避光孵育2 h；吸去上清液，加入DMSO 100 μL，置于孵箱中15 min，在多功能酶標儀測定各個孔在570 nm處的吸光度。細胞存活率計算公式： （OD樣品-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100%。半數有效量（50% effective dose,ED50）檢測時各個化合物濃度分別為10 nmol/L、 20 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、300 nmol/L；以含相同濃度DMSO為對照組，其余操作與MTT檢測相同。

1.2.5 LDH法檢測化合物對Glu誘導HT22細胞損傷的保護作用：當HT22細胞處于對數生長期時進行實驗，使用胰酶將細胞消化，離心，棄去舊培養基，加入適量新培養基，調整細胞密度，吸取100 μL細胞液于96孔板中使細胞密度達到1×104/孔。24 h后棄舊液，加入各濃度MB及其類似物100 μL，使各化合物濃度為100 nmol/L。細胞分為對照（CT）組、Glu組、藥物處理組，測定時以上分組分別測定樣品對照OD值（不加輔酶I）和樣品測定OD值（加輔酶I），各組LDH釋放百分率計算公式為： （樣品測定OD值-樣品對照OD值）/（正常組測定OD值-正常組對照OD值）×100，實驗重復3次。

1.2.6 H2DCF-DA染色法檢測細胞內ROS：H2DCF-DA染色用于檢測細胞內ROS含量的常用方法。當HT22細胞處于對數生長期時進行實驗，使用胰酶將細胞消化，離心，棄去舊培養基，加入適量新培養基，調整細胞密度，吸取500 μL細胞液于24孔板中使細胞密度達到1×104/孔。24 h后棄上清液，加入各濃度MB及其類似物500 μL，使各化合物濃度為 100 nmol/L，化合物預處理30 min后，均加入終濃度為2 mmol/L的Glu，孵育12 h，同時設置DMSO對照組（CT組）和Glu組。細胞處理結束后吸走培養基，用預溫PBS輕輕洗細胞2次，吸干PBS，每孔加入500 μL含10 μmol/L H2DCF-DA的無血清DMEM培養基，37 ℃孵育30 min，吸走培養基，用預溫PBS輕輕洗細胞兩次，以0.25%胰酶消化收集細胞，1 000×g離心5 min，棄上清液，每管加入200 μL無血清DMEM培養基重懸細胞，加入到96孔黑板中，熒光分光光度計測量熒光強度，H2DCF-DA的激發光波長為490 nm，發射光波長為525 nm。

1.2.7 Western blot檢測蛋白水平：細胞處理后，棄去培養基，PBS輕洗細胞2次，使用三去污裂解細胞，置于冰上裂解30 min，離心取上清液；使用BCA法檢測各組細胞總蛋白量。調整各組細胞濃度到同一濃度。在沸水中煮7 min使蛋白變性。使用8%～10%的SDS-PAGE電泳，電轉（60 min，300 mA）。使用脫脂牛奶封閉液孵育PVDF膜，在搖床上使用TBST溶液洗PVDF膜，共3次，每次5 min。在4 ℃冰箱中孵育一抗12 h；在常溫下孵育二抗1～2 h，在搖床上使用TBST溶液洗PVDF膜，共3次，每次5 min。顯影時在每張膜上滴加發光液，顯影成像。

1.2.8 siRNA干擾：細胞接種于35 mm培養板，待細胞密度為40%～60%開始轉染。配制轉染溶液：A：10 μL siRNA+250 μL Opti-MEM，混勻；B：5 μL lipofectamine 3000+250 μL Opti-MEM，混勻，室溫靜置5 min；配制A液和B液期間將細胞用PBS洗2次，加入1.5 mL Opti-MEM；20 min后，在細胞培養皿中加入500 μL的A、B混合液，混合混勻；將細胞放回37 ℃培養箱中繼續培養4～6 h后將轉染液換成完全培養基繼續培養，用于Western blot實驗和MTT實驗。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS軟件進行數據統計處理。數據用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t法。根據數據結果使用Graphpad prism 7.0制作柱狀圖，使用Adobe Photoshop作Western blot條帶圖。所有實驗均重復3次。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MB及類似物對HT22細胞活力的影響 與CT組相比，Glu組細胞存活率明顯降低（P＜0.01）。1～10 μmol/L的2-C、A-A、A-B分別處理HT22細胞24 h，均未見明顯毒性（P＞0.05）。10 μmol/L NR與MB能夠明顯降低細胞活力（P＜0.01）。2-C在10 μmol/L 濃度下能夠提高細胞活力（P＜0.01）。見圖2。LD50計算結果顯示，MB：LD50=（50.66±5.87）μmol/L， 2-C：LD50=（175.90±16.53）μmol/L，A-A：LD50=（152.40±18.36）μmol/L，A-B：LD50=（140.40± 12.48）μmol/L，NR：LD50=（73.19±8.49）μmol/L，結果表明化合物2-C、A-A、A-B及NR對HT22細胞的細胞毒性均低于MB。

圖2 MB及類似物對HT22細胞活力的影響

2.2 MB類似物抗Glu誘導的HT22細胞損傷作用 NR 在30～300 nmol/L濃度范圍對Glu誘導的HT22細胞損傷沒有明顯保護作用（P＞0.05）；30 nmol/L濃度的2-C、MB、A-B能夠明顯提高HT22細胞存活率（P＜0.01），其保護作用呈劑量依賴性。A-A在30 nmol/L 濃度下未顯示明顯保護作用，但在100 nmol/L和300 nmol/L濃度時均能明顯提高細胞存活率（P＜ 0.01），見圖3。EC50計算結果顯示，2-C[EC50=（34.32± 4.93）nmol/L]抗Glu誘導細胞損傷活性高于MB [EC50=（42.13±5.21）nmol/L]。A-A EC50=（48.96± 4.64）nmol/L，A-B EC50=（44.42±2.76）nmol/L。 LDH實驗結果與MTT結果一致：2-C、A-B、A-A在 100 nmol/L濃度下均能顯著降低Glu誘導的LDH釋放（P＜0.01），而NR對Glu誘導的LDH釋放無明顯作用，見圖4。

圖3 MB類似物對Glu誘導的HT22細胞的保護作用

圖4 MB類似物對Glu誘導的HT22細胞中LDH釋放的影響

2.3 MB類似物減少Glu誘導的HT22細胞內ROS Glu組細胞內ROS含量明顯升高，在100 nmol/L濃度下，NR處理組對Glu誘導產生的ROS沒有明顯改善；2-C，A-B、A-A均能夠明顯降低Glu誘導的ROS水平。見圖5。

圖5 MB及類似物減少HT22細胞中Glu誘導產生的ROS水平

2.4 MB類似物對MEF2D蛋白表達的影響 采用Western blot法檢測化合物對HT22細胞內MEF2D 蛋白水平的影響，結果見圖6，Glu可顯著降低HT22細胞內MEF2D蛋白水平（P＜0.05），而化合物2-C、A-B、A-A和MB在100 nmol/L濃度下即能夠明顯升高HT22細胞內MEF2D水平（P＜0.05或P＜0.01），NR對HT22細胞中MEF2D蛋白水平沒有明顯影響（P＞0.05）。

圖6 MB類似物提高HT22細胞中的MEF2D蛋白水平

2.5 干擾MEF2D對MB類似物抗Glu誘導HT22細胞損傷作用的影響 采用siRNA干擾序列，抑制細胞中MEF2D表達，進一步檢測MB類似物抗Glu誘導HT22細胞損傷作用，結果顯示干擾MEF2D后，化合物2-C、A-B、A-A對HT22細胞的保護作用明顯降低（P＜ 0.01），這一結果提示MEF2D至少部分參與了化合物2-C、A-B、A-A抗Glu誘導的HT22細胞損傷作用。見圖7。

圖7 siRNA干擾MEF2D后對MB類似物抗Glu誘導HT22細胞損傷作用的影響

2.6 MB類似物激活Akt/GSK-3β/MED2D通路 采用Western blot法檢測MB類似物對T-Akt、p-Akt、T-GSK-3β、p-GSK-3β蛋白水平的影響。100 nmol/L 2-C、A-B、A-A處理細胞24 h后，細胞內p-Akt/T-Akt比值顯著提高，p-GSK-3β/T-GSK-3β比值同樣明顯升高（P＜0.05）。見圖8。

圖8 MB類似物激活Akt/GSK-3β通路

2.7 Glu細胞模型中MB類似物激活Akt/GSK-3β/MED2D/ND6通路 在Glu誘導的HT22細胞氧化損傷模型中發現2-C、A-B、A-A能夠激活Akt，增加GSK-3β磷酸化來抑制GSK-3β活性，提高MEF2D蛋白水平，同時能夠提高線粒體編碼蛋白ND6的蛋白水平（P＜0.05），見圖9。這一結果進一步證明Akt/GSK-3β/MEF2D/ND6可能與2-C、A-B、A-A的抗氧化損傷作用密切相關。

圖9 Glu誘導HT22細胞氧化損傷模型中MB類似物激活Akt/GSK-3β/MEF2D/ND6通路

3 討論

MB是首個全人工合成的吩噻嗪結構藥物，具有廣泛的生物活性。近年來，相關研究發現MB類似物具有MB相似的生物活性，包括抗菌作用、調控NO/cGMP信號通路、抑制單胺氧化酶活性產生抗抑郁作用、抗氧化損傷作用等[5-8]。然而，目前MB類似物抗氧化作用及其作用機制研究鮮有報道，深入研究MB類似物的抗氧化作用及其機制，將為該類藥物的研發、結構改造及臨床應用提供重要的實驗依據。

本次研究發現具有酚噻嗪結構的化合物2-C、A-B、A-A具有顯著的抗Glu誘導的氧化損傷作用，均在nmol/L濃度水平發揮明顯的抗氧化作用，而不具有酚噻嗪結構的NR未顯示抗氧化損傷作用。此外，MTT實驗結果發現：與MB比較，2-C具有更強的抗氧化損傷作用及更低的細胞毒性。

目前，研究證明MEF2D能夠參與神經元的分化并促進神經元存活[16]。多項研究發現MEF2D蛋白水平下調與多種神經退行性疾病有關包括PD、 AD[14，17-19]。如：GUO等[20]研究發現羥黃酮抑制神經元凋亡等神經保護作用與其激活MEF2D有關。YAO等[21]研究認為B3C可通過激活MEF2D，產生保護多巴胺能神經元，改善PD運動缺陷。

機制研究發現Akt/GSK-3β參與調節MEF2D表 達[22-23]。研究發現MEF2D受到GSK-3β的磷酸化修飾，MEF2D磷酸化后通過Caspase途徑介導降解[18，24]。

近年來研究發現MEF2D不僅在細胞核中作為轉錄因子調控基因表達，MEF2D也定位于線粒體，并參與調控線粒體基因表達。ND6是線粒體復合體I的重要組成成分。研究發現ND6基因突變或者ND6蛋白水平下降，可引起線粒體復合體I結構改變進而引起線粒體功能障礙[25-26]。前期研究證明MEF2D可促進線粒體編碼蛋白ND6的轉錄翻譯，提高線粒體復合物I活性，從而提高線粒體功能，降低細胞內氧化應激水平[27]。此外，研究結果表明：ND6基因中MEF2結合位點突變則會干擾線粒體復合體I的形成，引起細胞氧化應激損傷。

前期研究發現MEF2D參與MB抗Glu誘導HT22細胞損傷作用，且這一作用可能與MB的中樞神經系統保護作用密切相關[28]。因此，本研究在發現2-C、A-B、A-A具有抗氧化作用的基礎上進一步探究了MEF2D與其作用的相關性。我們檢測了2-C、A-B、A-A對HT22細胞中MEF2D蛋白水平的影響，并檢測了敲低MEF2D后對2-C、A-B、A-A抗氧化損傷作用的影響，結果顯示siRNA敲低MEF2D后部分取消2-C、A-B、A-A抗氧化損傷作用，以上結果表明MEF2D參與了2-C、A-B、A-A抗氧化損傷作用。此外，我們采用Western blot法檢測2-C、A-B、A-A對Akt/GSK-3β/MEF2D/ND6通路的作用，結果顯示2-C、A-B、A-A顯著激活Akt，促進GSK-3β磷酸化使其失活，這一作用可能與化合物升高HT22細胞內MEF2D、ND6蛋白水平有關。

綜上所述：本次研究通過對2-C、A-B、A-A、NR四種MB類似物的抗氧化作用及其機制進行研究結果進行分析得出：①吩噻嗪結構可能對該類化合物的抗氧化損傷活性起到重要作用；具有吩噻嗪結構的化合物2-C、A-B、A-A與MB具有非常顯著的抗氧化損傷活性；②2-C與MB相比具有更低的細胞毒性，且其抗Glu誘導細胞損傷作用效價強于MB；③2-C、A-B、A-A的抗氧化損傷作用可能與其調節Akt/GSK-3β通路，提高MEF2D、ND6蛋白水平，促進線粒體功能有關；以上結果為后續進一步開展MB類似物在氧化應激相關疾病中的研究奠定實驗基礎，并為MB類似物的合成、結構改造等領域研究提供參考。