Tim-3調控巨噬細胞極化在克羅恩病發生發展中的作用

林道潑，邵曉曉，胡定元，吳昊，蔣益

溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 消化內科，浙江 溫州 325027

腸道巨噬細胞是參與腸黏膜免疫系統構建的重要細胞之一，在保護腸黏膜免遭病原體侵害以及調節腸道炎癥反應中均發揮重要作用[1]。研究表明，M0型巨噬細胞在不同局部微環境因素作用下可極化為促炎的經典激活型巨噬細胞（M1型）和抗炎的替代激活型巨噬細胞（M2型）兩種表型[2]。當微環境發生改變，將觸發巨噬細胞的表型和功能在M1和M2型之間動態變化，稱為巨噬細胞極化[3]。

克羅恩病（Crohn’s disease, CD）是一類病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，可累及口腔至肛門的各段消化道。多數研究提示巨噬細胞數目和功能異常與CD發病密切相關[4]。目前治療CD常用的一線生物制劑如英夫利昔單抗（infliximab,IFX）和烏司奴單抗（ustekinumab, UST）均能通過抑制巨噬細胞相關炎性信號通路和（或）誘導抗炎型巨噬細胞極化，影響巨噬細胞功能[5-6]。研究表明IFX治療后黏膜愈合的炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases, IBD）患者腸組織中，CD68+CD206+M2型巨噬細胞的數量顯著增多，提示M2型巨噬細胞的誘導可能參與黏膜愈合過程[6]。亦有學者通過調節巨噬細胞相關信號通路開發治療IBD的新型藥物，如磷酸二酯酶4（phosphodiesterase-4, PDE4）抑制劑[7]。因此，積極研發新的靶向巨噬細胞的藥物，可能有助于IBD疾病控制。

人類T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白3（T cells immunoglobulin domain and mucin domain protein 3, Tim-3）最初被發現于輔助性T細胞（T helper cell, Th）1上，Tim-3與其配體半乳糖凝集素（galectin, GAL）-9結合后能誘導已激活的Th1凋亡，直接抑制Th1型免疫反應。近期研究發現，Tim-3在各種固有免疫細胞，如自然殺傷細胞、巨噬細胞中都存在表達且發揮不同調控作用[8]。與其公認的對T細胞免疫的負調節作用相反，Tim-3對巨噬細胞的作用是復雜且有爭議的，取決于不同的疾病微環境[9]。因此本研究擬基于生物信息學，探索Tim-3在CD患者腸組織中的表達及其可能的臨床意義，并進一步分析Tim-3表達與巨噬細胞的關系，為詮釋Tim-3影響IBD發病的潛在機制提供線索。

1 對象和方法

1.1 數據來源 從美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）的公共基因表達數據庫（gene expression omnibus, GEO）中下載CD的表達譜芯片。表達譜芯片下載編號為GSE112366、GSE75214、GSE16879和GSE186582。GSE112366共包含66例活動期CD患者、35例緩解期CD患者和26名健康受試者的人腸組織標本，測序平臺為GPL13158；GSE75214包含59例活動期CD患者、16例緩解期CD患者和22名健康受試者的人腸組織標本，測序平臺為GPL6244。GSE16879共包含37例活動期CD患者和12名健康受試者的人腸組織標本，測序平臺為GPL570；GSE186582共包含102例活動期CD患者和25名健康受試者的人腸組織標本，測序平臺為GPL570。

1.2 數據標準化 使用GEO2R在線工具，通過探針ID號查找到Tim-3基因在腸組織中的mRNA表達量，當多個探針對應Tim-3基因時取最大值。同時獲取各芯片中CD患者對應的臨床數據（內鏡下評分和生物制劑應答情況），以分析Tim-3的mRNA表達與生物制劑療效和疾病嚴重程度的相關性。GSE16879數據集共篩選37例CD患者，其中結腸型CD患者19例，回腸型CD患者18例，均為經糖皮質激素或免疫抑制劑治療失敗的活動期CD患者。在IFX首次靜脈輸注前1周內進行內窺鏡檢查并取治療前活檢。如果患者只接受IFX（5 mg/kg）單劑靜脈注射治療誘導緩解，于第4周進行治療后內鏡下組織活檢；如患者采用IFX（5 mg/kg）于第0、2、6周靜脈注射治療誘導緩解，則于第6周接受治療后內鏡下活檢。所有活檢均取腸道炎癥部位。根據D’HAENS等[10]的評分標準進行CD患者腸組織內鏡下組織學評分。對結腸型CD患者，內鏡下組織學評分下降至少3分認為黏膜改善，11例患者達到黏膜改善為IFX應答組，8例患者未達到黏膜改善為IFX無應答組。而對回腸型CD患者，內鏡下潰瘍明顯改善或內鏡下組織學評分出現下降即認為IFX應答，共8例患者納入IFX應答組，10例患者納入IFX無應答組。GSE112366數據集共篩選37例中重度活動期CD患者，其CD活動指數（Crohn’s disease activity index, CDAI）為220～450分，既往均為激素、免疫抑制劑或IFX治療失敗，統一采用UST于第0周靜脈注射治療誘導緩解，給藥劑量根據體質量計算[260 mg（體質量≤55 kg），390 mg（55 kg＜體質量≤85 kg），520 mg（體質量＞85 kg）]，首次注射后隨訪6周，依據CDAI評分進行療效評估。CDAI評分下降大于100分，或者CDAI基線水平為220～248分的CD患者經治療后CDAI＜150歸為UST應答組，反之為UST無應答組，在第0周及第8周進行內窺鏡檢查并取腸道炎性部位組織進行活檢。

1.3 CD腸組織巨噬細胞浸潤分析 采用Cibersort計算方法估算所有活動期CD樣本中的巨噬細胞比例，計算次數設定在100次，然后進行質量過濾，只選擇P＜0.05的CD樣本進行巨噬細胞與Tim-3的mRNA表達之間的相關性分析。

1.4 免疫熒光技術檢測CD患者和健康對照者腸組織中Tim-3及CD68表達和CD68+Tim-3+巨噬細胞的比例 收集2020年10月至2021年9月溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院行結腸鏡檢查的12例活動期初治CD患者的炎性腸組織標本，其中男10例，女2例，年齡（26±6）歲。疾病部位：回腸末端型6例，結腸型0例，回結腸型6例，上消化道型2例。疾病行為：非狹窄非穿透型5例，狹窄型6例，穿透型1例，合并肛周疾病3例。依據2016年歐洲克羅恩和結腸炎組織（European Chron’s and Colitis Organization, ECCO）頒布的CD診治指 南[11]，經臨床、消化內鏡、實驗室、影像學及病理組織學等綜合確立CD診斷。納入前排除糖尿病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、腸結核、缺血性腸炎、放射性腸炎和腫瘤等疾病。研究方案取得醫院倫理委員會批準（倫理批件號：2021-K-90-02），觀察對象均知情同意。同期在溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院體檢中心收集15名健康對照者腸組織作為對照組，其中男12名，女3名，年齡（25±7）歲。納入前排除糖尿病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、腸結核、缺血性腸炎、放射性腸炎和腫瘤等疾病。將收集到腸組織進行免疫熒光雙染。按照三色多重熒光染色試劑盒的操作步驟進行操作，具體如下：腸組織標本常規行石蠟包埋、切片、脫蠟，使用3% H2O2封閉內源性過氧化物酶，3% BSA封閉。在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的一抗[抗兔CD68，1:1 000，英國Abcam公司；抗兔Tim-3抗體，1:300，美國CST公司]，避光濕盒內4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次，每次5 min，加 HRP二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。滴加不同發射波長的TYR熒光染料（TYR-488或TYR-CY3熒光染料）反應10～15 min。取出37 ℃復溫45 min后用PBS漂洗3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加DAPI染液室溫避光孵育10 min。PBS再洗3次，切片甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。用Image proplus 6.0計算每個樣本CD68+和CD68+Tim-3+細胞的數量，取5個視野平均值，由兩名研究者分別獨立閱片，最后計算CD68+Tim-3+細胞占CD68+細胞的比例。

1.5 實時熒光定量PCR法檢測CD患者和健康對照者腸組織中Tim-3及M1、M2型巨噬細胞相關細胞因子的mRNA表達 收集2022年7月至2022年10月溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院行結腸鏡檢查的6例活動期初治CD患者的炎性腸組織標本，其中男4例，女2例，年齡（28±5）歲。疾病部位：回腸末端型4例，回結腸型2例。疾病行為均為非狹窄非穿透型。同期在溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院體檢中心收集8名健康對照者腸組織作為對照組，其中男5名，女3名，年齡（29±6）歲。診斷及排除標準同前。將收集到的腸組織置于TRIzol液中裂解，0.2 mL氯仿抽提，離心，70%乙醇洗滌，DEPC水溶解，使用分光光度計測定總RNA的含量及濃度。cDNA合成具體步驟按照TaKaRa試劑盒說明書進行。引物序列見表1，基因PCR反應條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。以標準管家基因（GAPDH）為參照，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達水平。

表1 CD患者腸組織基因引物序列

1.6 統計學處理方法 本研究中GEO數據庫的原始數據采用GEO2R在線工具或GraphPad Prism軟件（version 8.0.1）分析。采用Shapiro-Wilk檢驗分析連續變量是否符合正態分布。正態分布的計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。偏態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Wilcoxon Signed Rank檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。采用Spearman秩相關進行相關性分析。將IFX治療第0周CD患者腸組織中Tim-3的mRNA表達水平作為參數，采用受試者工作特征（ROC）曲線分析這些參數對預測IFX療效的臨床價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Tim-3的mRNA水平在CD和正常腸組織中的表達差異 初步利用GEO數據庫分析CD患者腸組織和正常組織中Tim-3基因的轉錄水平，結果表明活動期CD患者腸組織中Tim-3的mRNA表達水平顯著高于對照組（P＜0.01）。對GSE112366和GSE75214數據集進一步分析發現，與緩解期CD患者相比，活動期CD患者腸組織中Tim-3的mRNA表達水平亦顯著升高（P＜ 0.01）。見圖1。

圖1 利用GEO數據庫中的轉錄組芯片GSE112366（A）、GSE75214（B）、GSE16879（C）和GSE186582（D）分析腸組織中Tim-3的mRNA表達水平

2.2 Tim-3的mRNA表達水平與CD患者疾病嚴重程度的關系及與CD患者生物制劑療效的關系 從GSE112366數據集中篩選有記錄CD簡化內鏡（SES-CD）評分的活動期CD患者，利用Spearman秩相關分析，觀察腸組織Tim-3的mRNA表達水平與SES-CD評分之間的關系。活動期CD患者腸組織Tim-3的mRNA表達水平與SES-CD評分呈正相關（r=0.39，P＜0.001）。根據初次IFX治療4～6周有無內鏡下緩解，從GSE16879數據集中篩選對IFX治療有應答的活動期CD患者19例，發現IFX治療后CD患者腸組織中Tim-3的mRNA表達水平較IFX治療前顯著降低（P＜0.01）。根據初次UST治療6周有無臨床應答，從GSE112366數據集中篩選對UST有應答的活動期CD患者16例，發現UST治療后腸組織中Tim-3的mRNA表達水平較UST治療前降低，但差異無統計學意義（P=0.07）。

為嘗試探索腸組織Tim-3的mRNA表達水平在CD患者中是否可以發揮早期的生物制劑療效預測作用，我們比較第0周CD患者IFX或UST治療前，IFX應答組與IFX無應答組腸組織中Tim-3基因的表達差異。與IFX無應答組相比，IFX應答組第0周腸組織Tim-3表達水平較低（P＜0.05）；而CD腸組織Tim-3表達水平在UST應答組和UST無應答組間差異無統計學意義（P＞0.05）。為進一步評估CD患者腸組織Tim-3的mRNA表達水平對預測IFX臨床療效的價值，本研究采用ROC曲線分析CD患者治療第0周檢測的腸組織Tim-3的mRNA表達水平對預測第4～6周IFX療效的價值（AUC=0.70，P=0.04）。見圖2。

圖2 利用GEO數據庫中的轉錄組芯片GSE112366、GSE16879分析CD患者腸組織中Tim-3基因表達與疾病嚴重程度和生物制劑療效的關系

2.3 Cibersort方法估算活動期CD樣本中的巨噬細胞比例及其與腸組織中Tim-3 mRNA表達水平的相關性 基于Cibersort算法分析CD腸組織中浸潤的M0、M1和M2巨噬細胞比例。相關性分析結果顯示，在GSE186582、GSE75214和GSE112366數據集中，活動期CD患者腸組織Tim-3的表達水平與巨噬細胞M0比例呈正相關（r=0.45，P＜0.05；r=0.48，P＜0.05；r=0.34，P＜0.05），見圖3。在GSE186582、GSE16879和GSE75214數據集中，活動期CD患者腸組織Tim-3的mRNA表達水平與巨噬細胞M1比例呈正相關（r=0.54，P＜0.001；r=0.53，P＜0.01；r= 0.61，P＜0.001），見圖4。而僅在GSE186582數據集中發現，活動期CD患者腸組織Tim-3的mRNA表達水平與巨噬細胞M2比例呈負相關（r=-0.43，P＜0.001），見圖5。

圖3 腸組織中Tim-3的mRNA表達水平與M0型巨噬細胞比例的相關性分析

圖4 腸組織中Tim-3的mRNA表達水平與M1型巨噬細胞比例的相關性分析

圖5 腸組織中Tim-3的mRNA表達水平與M2型巨噬細胞比例的相關性分析

2.4 免疫熒光技術檢測CD患者和健康對照者腸組織中Tim-3及CD68表達和CD68+Tim-3+巨噬細胞的比例 免疫熒光染色結果顯示，CD患者炎性腸黏膜中CD68和Tim-3表達均高于健康對照者正常腸黏膜。此外，CD68+Tim-3+雙陽性巨噬細胞占CD68+巨噬細胞比例在CD患者炎性部位亦顯著增多（P＜0.05）。見圖6。

圖6 免疫熒光技術檢測CD患者和健康對照者腸組織中Tim-3、CD68的表達和CD68+ Tim-3+巨噬細胞占CD68+巨噬細胞的比例

2.5 熒光定量PCR法檢測CD患者和健康對照者腸組織中Tim-3及M1、M2巨噬細胞相關細胞因子的表達 活動期CD患者腸組織中Tim-3 mRNA表達水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。Spearman秩相關分析結果顯示，活動期CD患者腸組織Tim-3 mRNA表達水平與M1型巨噬細胞相關細胞因子TNF-α和IL-1β的表達呈正相關（r=0.93，P＜0.01；r=0.85，P＜0.05），而與M2型巨噬細胞相關細胞因子IL-10和TGF-β的表達無明顯相關性（r=-0.04，P＞0.05；r=0.22，P＞0.05）。

3 討論

圖7 熒光定量PCR檢測活動期CD腸組織中Tim-3和M1、M2相關細胞因子的mRNA表達水平觀察活動期CD患者中Tim-3表達水平與M1、M2相關細胞因子水平之間的關系

KIM等[12]研究發現，活動期兒童CD患者腸組織中Tim-3的mRNA表達水平較健康對照者升高，而這些患者經IFX治療后腸組織中Tim-3的mRNA表達水平顯著降低，此外，在IFX治療期間，CD患者結腸黏膜中的Tim-3的mRNA表達水平與兒童CDAI呈正相關。與之一致，本研究通過生物信息學分析發現，與健康對照組相比，活動期CD患者腸組織中Tim-3表達升高，且與內鏡下SES-CD評分呈正相關。此外，對同一CD患者IFX或UST治療前后的情況進行自身比較發現，生物制劑治療后腸組織Tim-3的mRNA表達水平亦顯著下降。基于生物信息學的研究基礎，本研究進一步通過免疫熒光技術和實時熒光定量PCR法在本中心的臨床標本中進行驗證，結果顯示活動期CD患者炎癥腸組織中Tim-3表達較健康對照者正常腸黏膜顯著升高。上述結果提示活動期CD患者腸組織Tim-3表達變化與疾病活動密切相關。

迄今為止，多項研究表明Tim-3表達水平是反映自身免疫性疾病活動度的重要參數。ASANO等[13]研究發現，與健康對照者相比，SLE患者血清中可溶性Tim-3（soluable Tim-3, sTim-3）水平升高，且與SLE疾病活動指數SLEDAI-2K評分顯著正相關，進一步分層分析發現，合并腎臟受累的SLE患者血清sTim-3水平較無腎臟病SLE患者顯著升高，提示血清sTim-3可以作為SLE疾病活動度的預測指標。而對類風濕性關節炎患者的研究發現，類風濕性關節炎患者外周血單個核細胞和關節液中Tim-3+細胞比例較健康對照者升高，進一步流式細胞術證實CD4+、CD8+、自然殺傷T細胞和單核細胞上的Tim-3表達均增高，但外周血Tim-3+細胞比例與疾病活動指數和血清TNF-α水平呈負相關[14]。

研究表明，CD患者腸道手術史、疾病部位、是否合用免疫抑制劑、CRP等可能是影響IFX療效的重要因素[15]。但目前仍缺乏統一認可的，可特異性用于評估和預測IFX臨床療效的指標。本研究創新性采用ROC曲線評估CD患者腸道Tim-3的mRNA表達水平對預測IFX療效的臨床價值，結果發現在活動期CD患者接受IFX治療前，檢測腸組織Tim-3表達水平對IFX治療第0～6周的臨床療效可能具有預測價值，有望成為評估IFX療效的新指標。

目前普遍認為M1/M2型巨噬細胞極化是維持體內免疫炎癥穩態的重要機制，但Tim-3在巨噬細胞中的作用仍有爭議，在不同疾病中，巨噬細胞上的Tim-3可以調節M1和M2巨噬細胞之間的比例，作為促炎或抗炎調節因子[16-17]。YU等[16]研究發現，與野生型小鼠比較，腦出血小鼠腦血腫組織中M1型巨噬細胞比例增多，從而引起腦組織損傷。JIANG 等[17]對DSS誘導的急性結腸炎小鼠研究發現，注射抗Tim-3抗體會導致小鼠結腸組織中M1型巨噬細胞增加，小鼠病情加重，而Tim-3的轉基因過表達則可誘導M1型巨噬細胞減少，緩解病情。進一步分析發現Tim-3可能通過下游轉錄因子TRIF和IRF3促進M1巨噬細胞極化。本研究基于Cibersort算法分析CD腸組織中浸潤的巨噬細胞比例，發現活動期CD患者腸組織Tim-3的mRNA表達水平與巨噬細胞M0和M1比例呈正相關，免疫熒光結果亦發現，活動期CD患者炎性腸組織中CD68+Tim-3+巨噬細胞較正常腸黏膜顯著增多，熒光定量PCR結果提示Tim-3的mRNA表達水平與巨噬細胞M1相關細胞因子水平呈正相關，這提示Tim-3表達上調可能導致局部腸組織促炎型巨噬細胞應答上調，從而在CD疾病進展中發揮重要作用。導致本研究結果與基于小鼠的研究相矛盾原因可能如下：體外研究結果發現脂多糖可能通過Tim-3/galectin-9影響M1/M2巨噬細胞極化，且在不同時間點M1/M2比例存在動態變化[18]，因此我們推測在疾病的不同階段，Tim-3可能發揮不同作用。而既往的動物研究僅通過化學誘導方式模擬急性腸炎的過程，未模擬慢性活動性腸炎，這可能是本研究結果與既往基于小鼠的研究相矛盾的原因之一，此外，化學誘導的結腸炎模型僅能模擬IBD的某一方面，本研究擬后續采用基因工程模型或轉基因IBD動物模型進一步探討Tim-3在IBD中的作用。

綜上所述，本研究采用生物信息學和免疫熒光方法探討Tim-3表達水平與CD發生發展的關系，結果表明Tim-3可能通過影響M1型巨噬細胞極化在CD發生發展中扮演重要角色，且可能預測早期IFX療效（高水平Tim-3表達提示預后較差）。這些結果為Tim-3在臨床治療中的應用和CD的分子靶向治療提供了新的理論支持，但本研究患者樣本量較少，仍需后續加大樣本量，及更深入的機制研究加以證實。