錦菊素對銀屑病模型小鼠的藥效學作用及其機制探究

張 悅，陸 奕，楊婧雯，王鈺凱，張夢瑩，周 芳，王廣基，許正新，3

(1.揚州大學醫學院藥理學教研室，江蘇 揚州 225000；2.中國藥科大學，江蘇省藥物代謝動力學重點實驗室，中國醫學科學院“中藥復雜組分PK-PD結合研究”創新單元，江蘇 南京 210009；3.江蘇省非編碼RNA基礎與臨床轉化重點實驗室，江蘇 揚州 225000)

銀屑病是一種慢性自身免疫性疾病，目前其發病機制尚未完全闡明，其中遺傳因素和環境因素在該病的發生發展中起到關鍵作用[1]。銀屑病也會誘發多種并發癥，如銀屑病關節炎、2型糖尿病、血脂異常及其他心血管疾病[2]。多數研究認為易感人群表皮中的角質形成細胞受到創傷、感染、藥物或UV等刺激后會釋放炎癥信號激活樹突狀細胞，而被樹突狀細胞活化的Th17細胞會進一步釋放IL-17A、IL-17F和IL-22等細胞因子，后者可作用于角質形成細胞，誘導表皮快速增生[1]。對于銀屑病的上述病理生理變化，目前臨床上常用JAK激酶抑制劑和針對IL-17、IL-23和TNF-α等炎癥因子的單抗藥物進行治療，但這些療法治標不治本，停藥后極易復發[3]。因此，尋找治療銀屑病的潛在有效藥物成為該領域研究的熱點之一。

旋覆花屬菊科植物約有100多種，主要分布在歐洲、非洲和亞洲等地區[4]。在中國傳統醫學中常用于止咳、平喘、消痰[5]。旋覆花中存在含量豐富的倍半萜類、黃酮類及甾體類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種生物活性[4]。錦菊素是源自旋覆花的一種天然化合物，結構上屬于倍半萜內酯類。體外研究表明，錦菊素能夠調節NF-κB信號通路從而抑制免疫細胞黏附在內皮細胞上[6]。然而，有關該化合物對自身免疫性疾病是否有效或者其效應怎樣尚未可知。本研究旨在闡明錦菊素對咪喹莫特誘導的銀屑病模型小鼠的癥狀、體征的影響及其相關的作用機制，從而為臨床治療銀屑病提供新的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞C57BL/6小鼠，8～10周齡，雌性，體質量(18～20)g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(浙)2019-0001。飼養條件：溫度20～25 ℃、環境相對濕度45%～65%，12 h明暗交替。所開展的實驗均經揚州大學動物實驗倫理審查委員會批準。實驗依據動物實驗相關指南和法規進行，倫理批準號：YXYLL-2021-147。HaCaT細胞來自中國藥科大學單云龍實驗室的饋贈。含雙抗和10%的胎牛血清的MEM培養基置于37 ℃，CO2體積分數為5%的培養箱中常規培養。

1.2 藥物與試劑錦菊素，純度≥98%(來自中國藥科大學單云龍實驗室的饋贈)；咪喹莫特乳膏(5%)(Aldara，iNova Pharmaceuticals公司)；TRIzol(TaKaRa公司)；CCK-8試劑盒(碧云天公司，C0037)；p-P65抗體(3033)、P65抗體(8242)、Ki67抗體(9449)、Actin抗體(3700)和HRP偶聯二抗(7074和7076)均購自Cell Signaling Technology公司；熒光二抗Alexa Fluor 488(Thermo Fisher Scientific公司，R37114)；CBA試劑盒(BD公司，552364和560283)；C18色譜分離柱(Phenomenex公司)；胎牛血清(Gibco公司，10091-148)；不完全MEM培養基(凱基生物，KGM41500-500)；青霉素-鏈霉素(碧云天，C0222)；小鼠FoxP3流式抗體(Thermo Fisher Scientific公司，15-5773-80)；小鼠IL-17A流式抗體(BD公司，560184)；FcX封閉抗體(101319)、流式細胞死活染料(423102)、小鼠CD4流式抗體(100547)和小鼠CD25流式抗體(102008)均購自Biolegend公司；GTVisionTMIII抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(GeneTech公司，GK500705)；丙酮(南京試劑)。

1.3 儀器Eppendorf 5810R 型高速離心機(Hamburge，德國)；Sorvall Biofuge Stratos低溫高速離心機(德國)；Olympus FV 3000激光共聚焦顯微鏡(日本)；BioTek Lionheart FX全自動顯微鏡(美國)；超高效液相色譜系統(日本島津)；API 4000三重四極桿質譜聯用(美國)；CytoFLEX S多色流式細胞儀(美國)。

1.4 動物處理20只C57BL/6小鼠隨機分為如下組(每組5只)：空白對照組、模型對照組、實驗組錦菊素低劑量組(16.45 μmol·kg-1)、高劑量組(65.80 μmol·kg-1)。造模前1 d在小鼠背部剃毛，面積約2 cm×3 cm，觀察小鼠背部脫毛情況。造模當天，除空白對照組外的小鼠均于背部涂抹約62.5 mg咪喹莫特乳膏(5%)，連續造模5 d。自造模d 1起開始給藥(將溶解有不同劑量錦菊素的丙酮溶液分別均勻滴至對應組小鼠裸露的皮膚上，待溶劑揮干)，模型對照組則給與等體積的溶劑(丙酮溶液)，連續給藥5 d。于d 5小鼠眼球取血，同時取皮損處皮膚樣本測量皮膚厚度，肝、脾稱質量，將部分皮膚保存于4%多聚甲醛溶液，剩余皮膚保存于-80 ℃ 冰箱。

1.5 皮損面積和嚴重程度評分每天同一時段使用數碼相機給小鼠背部拍照，采用PASI評分法以紅斑、鱗屑、皮膚厚度3個指標對小鼠皮損嚴重程度進行評分。PASI評分標準：0～4分，按嚴重程度分為無、輕度、中度、重度、極重度，總分為3個指標分數之和(0～12分)。

1.6 小鼠皮損組織病理學改變取下小鼠背部皮損組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色。顯微鏡下觀察小鼠皮損組織病理學改變并拍照。使用ImageJ統計表皮厚度。

1.7 免疫組織化學法檢測小鼠皮損組織中Ki67的表達石蠟包埋，切片，脫蠟水化，加入抗原修復液冷修復，PBS清洗，室溫封閉，滴加一抗Anti-Ki67于4 °C孵育過夜，隔日滴加二抗孵育，DAB顯色與蘇木素復染，封片。顯微鏡下觀察Ki67的陽性細胞數量，并使用ImageJ計算陽性表達率。

1.8 HaCaT細胞的CCK-8檢測將錦菊素溶解于DMSO得到母液。取對數生長期的HaCaT細胞，胰酶消化后計數。調整細胞密度為5×106個·L-1，每孔100 μL接種于96孔板。每組設置5個復孔，邊緣孔用PBS填充，種板完成后置于培養箱培養。用完全培養基將錦菊素母液分別配制成濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mmol·L-1的錦菊素工作液；待細胞貼壁后，加入相應濃度的稀釋液，終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mmol·L-1；繼續放入培養箱培養24 h。24 h后取出吸棄原培養基，每孔加入100 μL含CCK-8的培養基。37 ℃，300 r·min-1離心30 min，酶聯免疫檢測儀在450 nm波長處測定各孔光吸收值(OD)。并選擇對細胞活力無影響的錦菊素劑量進行后續實驗。每個實驗進行3次生物學重復。

1.9 PCR檢測炎癥基因表達采用實時熒光定量PCR法檢測炎癥基因表達，引物由生工生物公司合成。將皮膚組織置于玻璃勻漿器中研碎，隨后加入TRIzol提取總RNA，按試劑盒說明書逆轉錄后進行PCR擴增得到cDNA。各炎癥因子基因檢測引物設計如下：IL-1β：F：CTTCAGGCAGGCAGTATCACTC，R：TGCAGTTGTCTAATGGGAACGT。IL-6：F：ACAAC CACGGCCTTCCCTAC，R：TCTCATTTCCACGATTTCC CA。IL-17A：F：CTGGAGGATAACACTGTGAGAGT，R：TGCTGAATGGCGACGGAGTTC。S100a8：F：AAA TCACCATGCCCTCTACAAG，R：CCCACTTTTATCAC CATCGCAA。S100a9：F：ATACTCTAGGAAGGAAGG ACACC，R：TCCATGATGTCATTTATGAGGGC。用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

1.10 Western blot檢測將細胞裂解后進行定量和變性。經SDS-PAGE凝膠電泳后轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入相對應一抗4 ℃孵育過夜，洗去未結合一抗，加入偶聯辣根過氧化物酶的相應種屬的二抗，室溫搖床上孵育2 h。結束后取出條帶，加入化學發光顯色液，曝光顯影。

1.11 流式細胞術取小鼠淋巴結進行研磨。重懸取單細胞懸液加入流式細胞死活染料，冰上孵育15 min，洗去染料后加入FcX封閉抗體封閉15 min；再加入膜表面流式抗體冰上孵育30 min；將細胞打孔后，加入預混完的胞內流式抗體孵育液，冰上孵育30 min；棄去抗體，洗2次后上機檢測。

1.12 細胞因子微球檢測技術將凍干的細胞因子標準品轉移至離心管，用2 mL檢測稀釋液稀釋成最高濃度標準品，室溫平衡15 min。按照每樣品管10 μL的量分別取300 μL捕獲微球，將所有微球混合于一只流式管中，渦旋混勻。取10只流式管，在除最高濃度標準品管外的9只管中先加入300 μL檢測稀釋液，再從最高濃度的管中取300 μL，依次按照1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128和1 ∶256的比例連續稀釋，再取一管濃度設置為0 ng·L-1作為陰性對照。渦旋混合微球管。9個濃度的標準品及每份樣品分別取50 μL與混合微球50 μL混合，混合完成向上述管中加入50 μL PE檢測抗體，室溫避光孵育2 h。孵育結束每個管中加入1 mL洗液清洗。離心200×g，5 min。棄上清，每管加入300 μL洗液重懸。準備儀器調試試劑，上機進行檢測[7]。

1.13 質譜檢測用純水與乙腈提取血清、皮膚組織中的錦菊素，然后通過超高效液相色譜系統與配備渦輪離子噴霧電離源的三重四極桿質譜聯用進行定量分析。色譜分離柱[C18(2) 100 ?，LC 250 mm 4.6 mm，5 μm]。二元溶劑體系為5 mmol·L-1乙酸銨+ 0.1%的水(A)+甲醇(B)，二元溶劑的梯度為：1%相B維持1 min, 5 min時上升至70%，保持3 min, 9.5 min時下降至1%，以0.2 mL·min-1的速率2.5 min達到平衡。數據由Analyst 1.5.2處理。

2 結果

2.1 錦菊素改善咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病皮膚炎癥基于每日同一時間觀察并記錄小鼠背部皮膚狀態，發現咪喹莫特造模后小鼠背部皮膚持續損傷，出現鱗屑和皮膚紅腫現象；給予錦菊素處理后顯著改善小鼠上述皮膚損傷現象，其中錦菊素經皮給藥高劑量組效應更顯著(Fig 1A)。結合皮膚厚度評分(Fig 1B)、紅腫評分(Fig 1C)、鱗屑評分(Fig 1D)以及綜合的PASI評分(Fig 1E)發現咪喹莫特持續加重小鼠銀屑病皮損癥狀，而錦菊素可連續減輕其癥狀，且結果具有統計學意義。d 5小鼠背部皮膚測量結果顯示，與空白對照組相比，模型組的皮膚厚度明顯增加；經錦菊素治療后，皮膚厚度減小，表明錦菊素可以顯著緩解咪喹莫特誘導的皮膚增厚(Fig 1F)。以上結果說明，錦菊素可以顯著改善咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮膚癥狀。

2.2 錦菊素抑制銀屑病小鼠皮損組織中角質形成細胞的過度增殖及炎癥反應Fig 2 HE染色結果顯示，與空白對照組相比，模型組表皮厚度增加；與模型組相比，錦菊素給藥組表皮厚度減小，說明錦菊素能夠明顯降低咪喹莫特誘導的小鼠表皮增厚。采用免疫組織化學法檢測各組小鼠皮損組織處Ki67陽性表達情況，我們觀察到模型組Ki67陽性細胞百分率明顯高于空白對照組，而錦菊素給藥組的Ki67陽性細胞百分率低于模型組，說明咪喹莫特會顯著增加小鼠表皮基底部位細胞的增殖，而錦菊素可以顯著改善該現象(Fig 2C、D)。同時，通過PCR檢測各組小鼠皮膚中炎癥因子的mRNA表達情況。檢測結果顯示，模型組小鼠皮膚組織中S100a8、S100a9、IL-17A、IL-6及IL-1β表達增加，錦菊素給藥后表達明顯降低，其中IL-17A及IL-6表現出明顯的劑量依賴性，說明給予錦菊素后可以顯著降低皮膚中各類炎癥因子的mRNA水平(Fig 2E-I)。上述結果表明，錦菊素能夠抑制銀屑病小鼠皮膚角質形成細胞的過度增殖及其炎癥反應。

2.3 錦菊素能夠降低銀屑病小鼠體內的炎癥水平鑒于Th17細胞的活化是正反饋誘導角質細胞過度增殖的關鍵因素[8]，采用流式細胞術進一步分析小鼠淋巴結中Th17細胞和抑制性Treg細胞的比例。流式細胞術的結果顯示，與空白對照組相比，模型組小鼠淋巴結中Th17細胞比例增加，具有免疫抑制作用的Treg細胞比例降低。與模型組相比，錦菊素能明顯降低小鼠淋巴結中Th17細胞比例，同時升高Treg細胞比例(Fig 3A和B)。此外，采用流式微球分析法檢測血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ及IL-17A的表達水平，結果顯示與空白對照組相比，模型組血清中上述細胞因子表達水平均明顯增高；與模型組相比，錦菊素給藥組能夠劑量依賴性地降低小鼠血清中上述細胞因子的水平(Fig 3C-G)。由此可知，錦菊素能夠降低咪喹莫特誘導的小鼠體內炎癥水平。

Fig 1 Effect of bigelovin on IMQ-induced psoriasis in mice

2.4 錦菊素蓄積在皮膚發揮作用為了觀察錦菊素發揮抗炎作用的靶器官，我們分別將小鼠背部皮膚與血清進行了質譜檢測。結果顯示，錦菊素在皮膚組織中的濃度較高，且呈現劑量依賴性。但血清中的錦菊素含量均低于檢測下限(Fig 4A)。說明涂抹給藥的錦菊素會蓄積在皮膚組織中發揮藥效，其靶細胞可能是皮膚中的角質細胞。進一步觀察脾臟指數、肝臟指數與體質量變化，結果顯示，相較于空白對照組，模型組肝臟指數與脾臟指數明顯升高；錦菊素給藥組相較于模型組肝臟指數與脾臟指數降低；與空白對照組相比較，模型組與錦菊素給藥組的體質量均明顯下降。結果表明咪喹莫特造模毒性較大，會引起小鼠體質量顯著下降與臟器異常增大，而錦菊素經皮給藥對于銀屑病小鼠不產生毒副作用(Fig 4B、C和D)。上述結果表明經皮給藥的錦菊素可能在皮膚組織發揮抗炎作用。

2.5 錦菊素可抑制咪喹莫特誘導的P65活化為選取不影響人角質細胞HaCaT細胞正常生長的藥物濃度進行后續實驗，采用CCK-8法檢測不同濃度的錦菊素對HaCaT細胞增殖的影響，其中給藥濃度在3 mmol·L-1時與對照組相比較，錦菊素對HaCaT細胞的增殖有明顯的抑制作用(Fig 5A)。進一步通過PCR檢測發現，咪喹莫特誘導HaCaT細胞中的IL-1β和IL-6的mRNA表達；與咪喹莫特組相比，錦菊素能夠明顯降低上述兩個炎癥因子的mRNA水平(Fig 5B和C)。

鑒于咪喹莫特為Toll樣受體7激動劑，能夠激活NF-κB信號通路，從而啟動下游IL-1β和IL-6的轉錄[9]。此外，有研究表明銀屑病患者的樣本中NF-κB活化，磷酸化P65水平升高[10]。我們進一步通過蛋白印跡實驗發現，經咪喹莫特刺激后，HaCaT細胞中P65磷酸化增加，NF-κB信號通路激活，錦菊素處理后HaCaT細胞中P65磷酸化水平顯著降低；未經咪喹莫特刺激僅給予錦菊素并不能引起P65磷酸化(Fig 5D)。同時，核蛋白分離和細胞免疫熒光檢測的結果顯示咪喹莫特能促進P65入核，錦菊素處理后可以顯著抑制P65入核(Fig 5E和F)。綜上所述，錦菊素在HaCaT細胞中可以顯著抑制咪喹莫特誘導的P65活化。

3 討論

本研究發現了旋覆花主要成分錦菊素可以緩解小鼠的銀屑病癥狀，并揭示了錦菊素靶向角質細胞抑制炎癥因子的釋放作用。結果顯示，錦菊素經皮給藥后會蓄積在皮膚組織中，而在血液中難以被檢測到，說明錦菊素經皮給藥發揮作用的靶器官可能是皮膚組織。

Fig 2 Epidermal proliferation and inflammatory cytokine profile in lesion skin affected by bigelovin

Fig 3 Inflammatory ecosystem in mice influenced by

Fig 4 Accumulation of bigelovin in lesion

Fig 5 Activation of P65 inhibited by bigelovin

損傷皮膚中異常的炎癥細胞因子表達已被證明是銀屑病發病機制的重要誘因。由S100a8和S100a9組成的鈣衛蛋白復合物已被確定為炎癥性疾病的生物標志物，包括類風濕性關節炎和銀屑病關節炎[11]。我們的研究顯示，錦菊素對皮損中炎癥相關基因S100a8和S100a9的表達有明顯的抑制作用，這表明錦菊素對銀屑病炎癥發揮了初步的改善作用。此外，我們也發現錦菊素對IL-17、IL-1β、IL-6和IFN-γ等多種炎癥因子的產生和釋放均有抑制作用，上述炎癥因子揭示了Th17細胞的活化水平[8]。綜上所述，我們推測錦菊素的靶細胞位于正反饋反應的上游。

銀屑病患者真皮和表皮內T淋巴細胞、巨噬細胞和中性粒細胞數量會顯著增加[12]。上述浸潤的炎性細胞中，Th17細胞可以迅速募集到損傷部位以產生促炎細胞因子[8]。我們觀察了錦菊素對Th17細胞和免疫抑制細胞Treg細胞的作用，發現錦菊素可以下調淋巴結中Th17細胞的比例，增加Treg細胞的比例。我們推測該現象可能與錦菊素抑制表皮細胞釋放促炎信號相關。

NF-κB信號傳導是細胞釋放促炎信號的重要通路之一，阻斷NF-κB信號活化已被證明可有效緩解銀屑病[13]。我們發現錦菊素能夠抑制P65活化和入核，從而降低角質細胞炎癥水平，其具體機制可能與IκBα的磷酸化相關[6]。但仍需要進一步闡明錦菊素的具體作用靶點及其通過何種方式介導NF-κB信號失活。目前，多種抗體藥物已被開發和批準用于治療各種疾病，如克羅恩病、類風濕性關節炎、強直性脊柱炎和銀屑病[14]。然而，抗體藥物在體內的續存時間較長，難以被機體快速代謝和排泄。長期使用抗體藥物，如TNF-α抗體，會導致嚴重的副作用，包括對細菌感染的易感性增加或潛伏性結核病的再激活[15]。與上述抗體藥物不同，經皮給藥的錦菊素可以避免這些副作用。

綜上所述，錦菊素在體內和體外均可以抑制角質細胞中促炎因子的表達及其P65的活化，從而改善咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病，為治療銀屑病提供了一種有效的候選藥物。