改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹脂納米結構顆粒對內毒素的吸附研究

裴宇盛，陳 晨，蔡 彤，陳丹丹，高 華

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹脂納米結構顆粒是一種新型快速止血、消除炎癥的醫療器械。研究表明[1-2]，常見的納米類成分能夠改善免疫細胞脫顆粒狀態，其抗炎機制可能與抑制機體肥大細胞功能活化，降低組胺及炎癥因子等相關介質的釋放有關，在病理上表現出對模型動物的保護作用。而本納米顆粒是以醫用高分子特異親和吸附材料為基礎，合成制備的具有“雙親性”的皂化醋酸乙烯酯/二乙烯基苯(saponification vinyl acetate/divinylbenzene，簡稱SVD)球狀顆粒共聚物骨架并固載分子手臂，以該高交聯低密度材料作為充填物，研發出的血液灌流器及口服膠囊劑型吸附材料，能夠特異性高效地清除高內毒素血癥患者血液內或腸源性的內毒素，以阻斷內毒素血癥的惡化。本課題組針對改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹脂納米結構顆粒對細菌內毒素的吸附能力開展研究，為其質量控制和和臨床應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材料 改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹脂納米結構顆粒(2021101301)由天津市權陽醫療器械有限公司提供；動態顯色法鱟試劑(2106090)購自湛江安度斯生物有限公司；細菌內毒素檢查用水(1810260)購自湛江安度斯生物有限公司；細菌內毒素國家標準品(150800-201601)由中國食品藥品檢定研究院提供；無水乙醇(20210121)購自國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉注射液(2012023104)購自石家莊四藥有限公司。

1.1.2儀器 Multireax型旋渦混合器(德國Heidolph)；ELx808型內毒素檢測儀(美國Biotek公司)。

1.2 方法

1.2.1納米材料的預處理 稱取納米結構顆粒1.0 g，置于50 mL無熱原的離心管中。加入10 mL無水乙醇，緩慢搖勻，浸泡10 min，用20 mL生理鹽水沖洗棄去液體，共洗5次。最后1次沖洗后、離心、去上清液，備用。

1.2.2內毒素的吸附 在離心管中加入用內毒素檢查用水制備的2 000 EU·L-1的內毒素標準品溶液10 mL，將離心管放入恒溫水浴振蕩器內，以(90±10)r·min-1的速率，(37 ±1)℃恒溫振蕩吸附2 h。

1.2.3標準曲線的建立及驗證 取細菌內毒素國家標準品，使用檢查用水復溶、稀釋，復溶時使用1 mL檢查用水，在旋渦混合器上混合15 min，將細菌內毒素溶液稀釋至濃度為104、103、102、10 EU·L-1，每步稀釋都應在混合器上混勻30 s，所得的4個濃度的標準細菌內毒素溶液每一濃度平行2孔加入到內毒素檢測反應酶標板中，每孔加樣體積為0.1 mL，即為標準曲線所需溶液；另在2孔中分別加入0.1 mL檢查用水，作為陰性對照；然后每孔均加入0.1 mL已復溶好的動態顯色法鱟試劑，放入酶標儀在405 nm處進行動力學檢測，檢測間隔30 s，檢測持續時間90 min。進行3次試驗，記錄每一濃度的響應值(Onset OD值)，并與陰性對照進行比較。

1.2.4改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹脂納米結構顆粒對內毒素吸附力試驗 使用1.2.3中的細菌內毒素標準溶液，以及1.2.2制備的取吸附后的所得溶液，根據2020版《中國藥典》通則1143中規定的光度法進行吸附后液體中的內毒素含量檢測。

1.2.5吸附率計算 按以下公式計算吸附率。

吸附率/% =(吸附前內毒素濃度-吸附后內毒素濃度)÷吸附前內毒素濃度×100 %。

2 結果

2.1標準曲線的建立及驗證結果3次試驗的結果的陰性對照的反應時間均大于標準曲線最低點濃度10 EU·L-1的反應時間。將儀器所測結果，進行雙對數轉化并采用線性擬合，標準曲線方程擬合結果見Tab 1。標準曲線結果符合規定。

Tab 1 Results of standard curve parameters

2.2 改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹脂納米結構顆粒對內毒素的吸附率納米顆粒在重量體積比(W/V)為10 kg·L-1的情況下，經過預處理、吸附后，可將2 000 EU·L-1的細菌內毒素標準溶液吸附至內毒素含量小于10 EU·L-1，計算吸附率數值為大于99.5%。

3 討論

細菌內毒素作為最常見的強力炎性誘導劑，通過被體液中的免疫細胞TLR4受體識別后，進而使免疫細胞分泌多種細胞因子，引起炎癥反應[3-6]。在嚴重創傷、感染等應激狀態下可出現全身網狀內皮系統功能障礙，免疫機能下降，腸道吸收的內毒素過多而超過機體清除能力等情況。胃腸道粘膜缺血、壞死、屏障破壞，大量內毒素釋放入血，腸道吸收的內毒素因肝功能障礙由側枝循環直接入體循環，或者某些組織、器官的感染也會引起外源性內毒素入血[7]。以上情況都會引發嚴重的內毒素血癥。改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹脂納米結構顆粒是通過吸附內毒素的方法，高效清除患者體內的內毒素，因此，本課題組開展了針對其內毒素吸附能力的研究。采用經典的細菌內毒素檢查法—鱟試驗法，使用納米材料吸附內毒素，考察評價納米材料對內毒素的吸附能力。實驗結果顯示，改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹脂納米結構顆粒對于細菌內毒素有高達99.5%以上的吸附力，提示該納米結構顆粒能夠有效吸附內毒素從而發揮藥理活性。納米結構顆粒對內毒素吸附的機制，可能與納米粒子的電性有關，對此我們將作進一步研究。