大豆根特異性GmPR1-9啟動子的鑒定及其在根腐病抗性中的應用

閆強，薛冬，胡亞群，周琰琰，韋雅雯，袁星星，陳新

大豆根特異性啟動子的鑒定及其在根腐病抗性中的應用

閆強，薛冬，胡亞群，周琰琰，韋雅雯，袁星星，陳新

江蘇省農業科學院經濟作物研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，南京 210014

【目的】鑒定大豆根特異性啟動子及其最小調控片段，并利用啟動子工程技術構建時空特異人工啟動子并評價其在根腐病抗性中的應用價值，為大豆抗疫霉根腐病的遺傳改良提供遺傳元件。【方法】通過分析大豆根、莖和葉片轉錄組數據，篩選在根中特異高水平表達的基因，克隆獲得其啟動子序列。根據順式元件的分布位置構建截短載體，并驅動報告基因在大豆發狀根組織中超表達，篩選控制根特異性表達的核心片段。將獲得的核心啟動子片段與疫霉菌誘導啟動子元件p4XD串聯構建人工啟動子驅動疫霉抗性相關基因在大豆發狀根中超表達，分析轉基因組織對疫霉菌抗性水平及目的基因在病原菌侵染過程中的表達水平。利用轉基因本氏煙草從整株水平評價轉基因材料對疫霉菌的抗性水平。【結果】通過篩選發現6個大豆根特異性表達的PR1同源基因，其中，具有最高的啟動子表達活性。PLACE在線預測發現其啟動子區域含有大量的根特異表達相關順式元件。對啟動子進行截短試驗，發現5′端截短片段L1、L2、L3、L4和L5均具有啟動表達活性，長度為166 bp的L5（-166—-1）片段具有全長啟動子80%的活性，并可驅動在轉基因煙草根中特異表達；3個3′端截短片段R1、R2、R3和1個雙端截短片段M1幾乎檢測不到GUS酶活性。p4XD-L5融合片段驅動在大豆發狀根中超表達后可顯著提高大豆發狀根對疫霉菌的抗性，超表達發狀根接種病原菌后發病程度和病斑長度顯著低于對照，疫霉菌絲積累量在接種48 h時減少66.5%。在超表達組織中始終維持在高表達水平，在接種前，表達量是對照組織的39.2倍，接種后，表達量受疫霉菌侵染誘導進一步上調，并在36 h達到最高。在p4XD-L5::NDR1轉基因本氏煙草根中的表達量顯著高于莖和葉片，表現出明顯的根部表達偏好性。超表達株系接種辣椒疫霉菌15 d后的株高、根長和鮮重顯著高于對照，同時葉片萎蔫率和病斑長度顯著低于對照植株。【結論】鑒定獲得一個大豆根特異性表達啟動子及其核心序列，融合誘導性和組織特異性啟動子核心元件的人工啟動子p4XD-L5驅動抗性基因超表達，可顯著增強轉基因大豆發狀根和本氏煙草對疫霉菌的抗病性。

大豆（）；根特異性啟動子；；人工啟動子；根腐病抗性

0 引言

【研究意義】大豆是植物蛋白最佳來源之一，也是全球重要的油料和經濟作物。在大豆生產過程中，由土傳病原菌引起的大豆根部病害是嚴重危害大豆生產的世界性病害。其中，由大豆疫霉菌引起的疫霉根腐病已成為世界大豆生產中的第二大病害，每年造成10億—20億美元的損失[1]。將作物天然抗病基因、人工設計廣譜持久的免疫受體蛋白以及優化整合不同類型的作物抗病基因導入目的作物，通過激發和強化作物自身免疫實現作物廣譜持久抗病是轉基因抗病育種的重要目標[2-3]。但植物的免疫與生長發育往往相互拮抗，同時抗病基因在目的植物中的非特異性表達往往存在適合度代價（fitness cost）的問題[4-5]。此外，外源基因在轉基因作物收獲器官的表達也會引起公眾對于轉基因產品安全性的擔憂。如何確保作物免疫與其他農藝性狀的協同調控，精準調控抗病基因在轉基因作物中的時空表達模式，是植物抗病轉基因育種的一個重要環節[3]。挖掘大豆根特異性啟動子并鑒定其核心調控元件；進而通過人工設計的手段構建根特異性且受疫霉菌誘導表達的人工啟動子，使抗病基因在高度可控的方式下驅動目的基因的表達，為轉基因技術在大豆抗病育種中的運用提供了新的思路，并進一步提高抗病基因在轉基因抗病育種中的利用價值。【前人研究進展】啟動子是調控基因表達的關鍵元件，其序列包含眾多順式調控元件，通過調控基因在時間和空間上的有序表達確保植物正常的生長發育和生命周期[6-7]。根據順式調控元件的表達特征，啟動子可以分為組成型啟動子、誘導型啟動子和組織特異性啟動子3種類型。作為植物遺傳操作的重要組成元件，目前，使用最多的是組成型啟動子，例如來自花椰菜花葉病毒的35S（CaMV35s）啟動子、水稻的Actin啟動子和玉米的Ubiquitin啟動子[8]。采用組成型超表達抗性基因的方式雖然使轉基因作物抗病性得到提高，但往往是在損失作物正常生長、發育和產量的前提下實現的，通過基因工程手段精確控制轉基因表達是提高植物抗病的關鍵[5]。將擬南芥脅迫誘導基因啟動子融合轉錄因子基因，導入煙草可以提高轉基因植株對干旱及低溫的抗性，同時，在正常生長條件下能夠顯著緩解由超表達引起的生長遲緩[9]。利用擬南芥根冠特異性表達的啟動子驅動線蟲殺蟲肽在擬南芥和馬鈴薯中超表達，顯著增強了轉基因株系對甜菜胞囊線蟲和馬鈴薯胞囊線蟲的抗性[10]。啟動子在限制殺蟲肽組成型表達的同時維持甚至提高了轉基因植物對胞囊線蟲的抗性。以上研究表明，病原誘導型或組織特異性啟動子在轉基因育種中具有巨大應用潛力。目前，從多種植物中分離獲得的根特異性啟動子被證明能夠驅動目的基因在轉基因植物根中特異表達[8, 11]。大豆根特異性啟動子及疫霉菌特異誘導表達啟動子也有報道，和啟動子能夠驅動在模式植物擬南芥根中特異表達[12-13]。人工合成啟動子122 bp片段的四重復單元，在煙草葉片中能夠響應疫霉菌侵染并驅動觸發細胞死亡[14]。【本研究切入點】目前，與其他作物相比，大豆根特異性啟動子及其核心啟動元件的研究仍有待深入，而組織特異性和誘導性啟動子在大豆抗疫霉根腐病中的應用鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究擬通過分析大豆幼苗期根、莖和葉片組織中基因表達水平，篩選根特異性啟動子并鑒定核心調控元件。進一步通過融合根特異性和疫霉菌誘導型啟動子核心元件構建人工啟動子并驅動抗性基因在大豆發狀根和本氏煙草中超表達，評價轉基因材料對病原菌的抗性，探討組織特異性、誘導型啟動子在轉基因大豆抗病育種中的利用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料及培養條件

大豆Williams和本氏煙（）種子均由江蘇省農業科學院經濟作物研究所豆類研究室保存。組培室及培養室均設置25℃，16 h光照/8 h黑暗光周期培養條件。大豆疫霉菌株P6497和辣椒疫霉菌株Pc35在25℃生化培養箱中培養。

1.2 序列比對及啟動子順式元件分析

從大豆基因組數據庫（Wm82.a4）中分別提取、、、、和轉錄起始位點上游1 500 bp啟動子序列。利用PLACE在線數據庫（https://www.dna.affrc.go.jp/ PLACE/?action= newplace）預測啟動子順式調控元件，利用TBtools軟件對根部特異表達相關元件在啟動子上的分布進行可視化分析[15]。

1.3 基因組織特異性表達分析

收集生長3周齡大豆Williams幼苗根、莖和葉片組織樣品，采用RNAsimple Total RNA Kit試劑盒（天根，北京）提取不同組織樣品總RNA，采用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Vazyme，南京）去除基因組和反轉錄，按照說明書操作獲得各組織cDNA。選擇6個候選基因的保守區段，利用Primer6軟件設計RT-PCR引物，擴增片段大小為450 bp（RT- GmPR1-9-F：5′-GCCTACGCTCAAGATTCA-3′；RT- GmPR1-9-R：5′-CAGTTTGTAGGGTCTTTCAC-3′）。大豆作為內參基因（GmACT11-F：5′-GGTG GTTCTATCTTGGCATC-3′；GmACT11-R：5′-CTTTC GCTTCAATAACCCTA-3′）。利用RT-PCR方法分析組織表達特異性。

1.4 啟動子克隆和載體構建

根據的1 500 bp啟動子序列，設計啟動子擴增引物（GmPR1-9-F：5′-gacctgcaggcatgcTTATCTGTGTGTCTGTGCTAAATAAATCA-3′；GmPR1-9-R：5′-ttaccctcagatctaTATATTAATTA TGCTTAATAGTATCACTTTCTTTAGC-3′），上、下游引物5′端分別含有pCAMBIA3301-GFP載體dⅢ和Ⅰ酶切位點同源臂序列。啟動子序列經純化后與線性化處理后的pCAMBIA3301-GFP進行同源重組反應（ClonExpress II One Step Cloning Kit，Vazyme，南京），轉化后挑取陽性克隆送南京擎科生物公司測序。截短載體構建與啟動子全長載體構建采用相同策略，與融合，與pCAMBIA3301-GFP載體連接，3′端引入mini35s小啟動子。所構載體經驗證后轉入發根農桿菌K599，用于大豆發狀根轉化。

人工啟動子p4XD-L5由南京擎科生物公司合成。PCR擴增獲得包含同源臂的p4XD-L5啟動子序列及序列[16]，并與經dⅢ、HⅠ雙酶切的pCAMBIA3300-GFP同源重組構建pCAMBIA3300- GFP-p4XD-L5::NDR1。該載體分別轉入K599和EHA105，用于大豆發狀根及煙草穩定轉化。

1.5 大豆發狀根及煙草穩定轉化

參考Yan等[17]方法，利用培養5 d的大豆子葉作為外植體誘導產生發狀根。待發狀根長出約3 cm時，用體視熒光顯微鏡篩選GFP陽性發狀根，切下，轉接到新鮮White培養基上繼代培養1周，切取根尖部位進行GUS染色分析，剩余組織材料液氮速凍后-70℃保存，用于GUS酶活性檢測。

采用農桿菌介導的葉盤法構建煙草轉基因材料，并收獲T0植株種子[18]。T1轉基因幼苗經50 mg·L-1草銨膦抗性篩選及熒光篩選后，移栽至營養土中繼續生長，并收集T2轉基因種子。

1.6 GUS染色及酶活性檢測

收集萌發10 d（MS培養基）且經熒光和草銨膦抗性篩選后的T2轉基因煙草幼苗和發狀根組織，用GUS染色液（50 mmol·L-1磷酸緩沖液、0.1%（v/v）Triton·X-100、2 mmol·L-1K4[Fe(CN)6]·3H2O、2 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]、10 mmol·L-1EDTA和2 mmol·L-1X-Gluc，pH7.0）37℃黑暗孵育12 h。然后，用70%酒精隔水加熱脫色處理直至背景無色，拍照記錄。

將大豆發狀根組織用液氮研磨成粉末，利用定量檢測試劑盒（Coolaber，北京）和Bradford蛋白濃度測定試劑盒（Coolaber，北京）進行蛋白提取、濃度測定、標準溶液及反應液配制。反應結束后，在激發光365 nm發射光455 nm條件下檢測熒光信號值。GUS酶活以每微克蛋白在單位時間（min）中生成4-MU的量（pmol）表示。

1.7 轉基因材料抗病性分析

采取以下2種方案接種大豆發狀根：（1）菌絲塊接種。從新鮮培養4 d大豆疫霉P6497菌絲邊緣切取3 mm3大小菌絲塊接種在發狀根伸長區，在接種24和48 h后測量病斑長度。（2）游動孢子液接種。從培養4d大豆疫霉菌絲邊緣用無菌手術刀切割2 mm3菌絲塊接種液體V8培養基中，25℃暗培養3 d。清洗菌絲3—4遍，至菌絲呈白色，加入少量滅菌自來水后繼續培養24 h，即有大量游動孢子釋放。過濾收集游動孢子，并稀釋至1×104個/mL備用。選擇生長狀態一致的發狀根幼嫩部位組織，浸泡在含有5 mL游動孢子液的離心管中。在接種后0、12、24、36和48 h收集樣品，利用qRT-PCR方法檢測組織中的表達水平和疫霉菌的相對生物量。疫霉菌相對生物量以疫霉菌內參基因積累水平與大豆內參基因積累水平的比值來衡量。

選擇生長6周齡且生長狀態一致的WT（野生型煙草植株）、EV（轉空載體植株）和3個p4XD-L5:: NDR1超表達本氏煙植株，緊靠煙草植株莖基部戳一個1 cm深的小洞，滴加1 mL（1×104個/mL）辣椒疫霉Pc35菌株游動孢子液。在接種0、5和10 d后拍照記錄發病表型，并在15 d統計接種植株地上莖上的病斑長度、葉片萎蔫比例、株高、主根長和植株鮮重指標。

2 結果

2.1 大豆根特異表達基因篩選及啟動子分析

從轉錄組數據中發現6個根特異性表達的病程相關蛋白（pathogenesis-related protein 1）基因：（）、（）、（）、（）、（）和（）（圖1-A）。其中，至位于第13染色體的同一基因座內，為串聯重復的同一家族基因；位于第15染色體。轉錄組表達分析顯示在根中表達水平最高（圖1-A），并且僅在根中檢測到基因表達（圖1-B）。

PLACE預測結果顯示，6個PR1基因啟動子區均含有大量根特異表達相關的作用元件：MYCCONSENSUSAT、OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODULE、RAV1AAT、ROOTMOTIFTAPOX1、SP8BFIBSP8AIB和SP8BFIBSP8BIB[19]。其中，包含最多的是MYCCONSENSUSAT和ROOTMOTIFTAPOX1（圖2）。前期試驗證明，啟動子在大豆發狀根中具有更強的驅動活性，因此，選擇該基因進行后續研究。

A：GmPR1-9及其同源基因的表達熱圖（log10FPKM）；B：GmPR1-9的RT-PCR分析

2.2 根特異性表達核心調控元件的篩選

為了挖掘啟動子核心調控元件，根據根特異性相關元件的位置，構建系列啟動子截短載體（圖3）。通過對轉基因發狀根進行GUS組織化學染色，結果表明，啟動子-405—-1 bp序列足以驅動表達。基于此，位于-405—-311（95 bp）、-310—-171（140 bp）、-166—-1（166 bp）的啟動子片段均能驅動表達。GUS酶活性檢測結果表明，啟動子全長與L1片段（-1 253—-1 bp）啟動活性相當；166 bp啟動子片段（L5）驅動活性為全長啟動子活性的80%；3個3′端缺失片段R1（-1 500—-171 bp）、R2（-1 500—-406 bp）、R3（-1 500—-1 254 bp）和1個雙端缺失片段M1（-1 253—-406 bp）幾乎檢測不到GUS酶活性（圖3和圖4）。以上結果說明，位于3′端的166 bp啟動子序列（L5）對于驅動在大豆發狀根中表達具有重要功能，該片段啟動子含有1個ROOTMOTIFTAPOX1和1個SP8BFIBSP8BIB順式元件（圖2）。

圖2 啟動子序列中根部特異表達相關的順式作用元件分布

A：pGmPR1-9啟動子截短示意圖。L1—M1：啟動子截短位置信息；B：轉基因發狀根GUS組織化學染色

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。下同 Different letters indicate significant differences (P<0.05). The same as below

為進一步驗證L5啟動子片段的根特異表達活性，將L5啟動子融合并導入本氏煙草植株。T2轉基因煙草種子在含有草銨膦的MS培養基上萌發并經GFP熒光篩選（圖5-A）。對生長10 d的陽性植株進行GUS組織化學染色，結果顯示，轉基因煙草根部均被染成藍色，而在葉片和莖中觀察不到藍色（圖5-B—圖5-E）。表明L5片段能夠驅動在煙草根部特異性表達。

2.3 p4XD-L5::NDR1超表達增強大豆發狀根對疫霉菌的抗性

為進一步確保L5片段能高水平啟動轉錄，在5′端融合488 bp的4XD疫霉菌誘導表達核心元件[14]，構建人工啟動子p4XD-L5，以確保驅動目的基因在感受病原菌侵染時的高水平表達。通過該啟動子驅動大豆疫霉菌抗性基因在大豆發狀根中超表達，比較轉基因組織對大豆疫霉菌的抗性水平，從而評價根特異性啟動子L5在植物抗病中的應用價值。結果顯示，在接種24 h后，對照發狀根出現明顯病斑，菌絲在接種點迅速積累并沿根表面向兩側擴展；接種48 h后，褐色病斑進一步擴展并出現水漬，菌絲在病斑區域大量積累（圖6-A）。p4XD-L5::NDR1轉基因根發病程度顯著低于對照，病斑長度也顯著小于對照（圖6-A和圖6-B）。p4XD-L5::NDR1轉基因根中的疫霉菌絲積累量在接種后的4個時間點均顯著低于對照組織，在接種48 h時，疫霉菌絲積累量與對照相比減少66.5%（圖6-C）。接種后表達量檢測結果表明，對照組織中在接種后上調表達并在48 h達到最高值（圖6-D）。而在p4XD-L5::NDR1轉基因發狀根中，始終維持在高表達水平。在接種前的表達量是對照組織的39.2倍，接種后表達量進一步提高并在36 h達到最高水平；接種48 h表達量略微降低，但仍是對照組織中表達量的22.5倍。以上結果說明，人工構建的p4XD-L5啟動子能夠驅動在大豆發狀根中表達且保持病原菌誘導表達特性，并增強轉基因根組織對疫霉菌的抗性。

A：轉基因煙草種子熒光篩選；B—E：10 d轉基因煙草幼苗、葉片、莖和根的GUS組織化學染色，bar=1 mm

A：發狀根接種大豆疫霉菌絲塊的病斑表型；B：病斑長度統計；C：大豆發狀根組織中疫霉菌相對生物量積累；D：大豆發狀根組織中GmNDR1的相對表達量。EV表示空載體對照。**表示處理間差異極顯著（P<0.01）。下同

2.4 p4XD-L5::NDR1超表達增強煙草對疫霉菌的抗性

為了從整株水平評價p4XD-L5::NDR1在植物對疫霉菌抗性中的功能，將p4XD-L5::NDR1轉入本氏煙草，并獲得T2轉基因株系。p4XD-L5驅動目的基因在根中表達量顯著高于莖和葉片（圖7）。WT、EV和3個p4XD-L5::NDR1轉基因株系接種5 d后均出現不同程度的萎蔫，但3個p4XD- L5::NDR1轉基因株系僅底部葉片發生萎蔫，且植株高度受影響較小（圖8-A和圖8-B）。接種10 d后，WT和EV植株出現明顯矮化、葉片萎蔫黃化，而3個p4XD-L5::NDR1轉基因株系發病表型明顯較輕，株高顯著高于對照（圖8-C和圖9-A），萎蔫葉片比例顯著降低（圖8-C和圖9-B）。p4XD-L5::NDR1轉基因株系莖基部病斑長度顯著小于對照接種植株（圖8-D和圖9-C）。此外，4XD-L5::NDR1轉基因株系主根長顯著大于對照植株（圖8-E和圖9-D），且植株鮮重高于對照（圖9-E）。以上結果表明，p4XD-L5::NDR1轉基因株系對辣椒疫霉菌的抗性顯著提高。

圖7 GmNDR1在轉基因煙草根、莖和葉片中的表達量

A—C：辣椒疫霉菌株Pc35游動孢子接種煙草0、5和10 d后整株表型；D—E：接種10 d后煙草莖基部和根系組織的病斑表型

A：株高；B：葉片萎蔫比例；C：病斑長度；D：主根長；E：植株鮮重

3 討論

3.1 pGmPR1-9是一個大豆根特異性啟動子

根特異性啟動子的挖掘及核心調控元件的鑒定，對于利用基因工程手段改良作物養分吸收、干旱及鹽堿等非生物脅迫和根部病蟲害等生物脅迫抗性具有重要意義[20-21]。目前，在水稻、煙草、馬鈴薯、番茄、大豆等作物中鑒定到一批根特異性啟動子，但其在作物遺傳改良中的應用還缺乏深入的研究[22-24]。本研究通過分析大豆幼苗期根、莖和葉片轉錄組數據，發現6個具有根特異表達特性的PR1同源基因。PR基因家族作為植物抗病研究中的一個明星基因，其表達強烈受到如卵菌、真菌、細菌、病毒侵染及昆蟲取食誘導。PR基因是一個包含17個家族成員的基因家族，其中PR1家族蛋白是一個富含半胱氨酸的分泌蛋白，其核心區域在不同物種中相對保守[25]。

在大豆中，通過對已公布的大豆轉錄組進行分析，發現24個PR1家族成員廣泛受到生物和非生物脅迫誘導表達，其組織表達特異性也存在多樣性[26]。PR基因的組織特異性在植物不同發育時期也存在差異，高麗參在3周齡幼苗期具有明顯的根表達偏好性，而在2年期植株體內則表現出葉片表達特異性[27]。豌豆中一個PR同源基因表現出根表皮及幼胚表達特異性[28]。小麥和均表現出強烈的根表達特異性，但是在葉片接種白粉菌后和的表達量受病原菌侵染誘導不斷升高[29]。擬南芥中屬于PR-5家族的類甜蛋白基因在受熒光假單胞誘導后在根維管組織中特異表達[30]。大豆則具有明顯的葉片表達偏好性[31]。以上研究表明PR基因組織特異性并非一成不變的，在本底表達水平極低的組織中，由于啟動子上病原誘導等順式調控元件的調控而表現出誘導表達特性。

本研究6個PR1基因啟動子區域均含有大量與調節根特異性表達相關的順式元件，通過截短試驗獲得具有全長啟動子80%活性的啟動子片段L5（166 bp）。轉基因試驗證明L5片段能夠驅動在轉基因煙草根部特異性表達，說明L5片段上的ROOTMOTIFTAPOX1和SP8BFIBSP8BIB調控元件對于驅動目的基因在根中特異性表達起著重要功能。前人報道將4拷貝的根特異性順式作用元件OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODULE、SP8BFIBSP8AIB和ROOTMOTIFAPOX1以串聯排列方式設計合成的根特異性模塊能夠驅動在轉基因煙草根中特異性表達[32]。本研究結果表明僅含有單拷貝ROOTMOTIFTAPOX1和SP8BFIBSP8BIB作用元件的更短序列仍在轉基因植株中賦予目的基因根特異表達特性。

3.2 植物時空調控啟動子在作物遺傳改良中的應用

外源基因的組成型高表達通常會產生多種不良效應。例如，超表達調控次生壁形成的轉錄因子基因和會引起薄壁細胞中的異位次生壁增厚，從而導致轉基因植物嚴重矮化[33-34]。因此，需要確保啟動子能夠在高度可控的方式下驅動目的基因的表達，以達到既能避免不良性狀的產生，又能在特定的組織或發育階段獲得目標性狀的目的。最近一個利用啟動子精確地修改作物性狀的例子是對水稻啟動子的研究，IPA啟動子一段54 bp關鍵順式作用元件的缺失使突變體表現出穗重和穗粒數同時增加、株高變高、莖稈和根系粗壯，實現了不同表型的特異性調控，從而打破了產量因素之間的負效應[35]。

由土傳病原菌引起的大豆根部病害是嚴重危害大豆生產的世界性病害。由于根部侵染的特性，在田間發生肉眼可辨病癥的時候往往已經處于發病后期，此時進行農藥防治難以取得預期效果[36]。因此，通過基因工程手段構建僅在根中特異表達抗病基因的轉基因品種是一種有前途的改良策略。本研究p4XD-L5不僅能夠驅動在根中高水平表達，而且保持受病原菌誘導上調表達的能力，從而增強了轉基因大豆發狀根組織和煙草植株對病原菌的抗性。在煙草中，沒有發現轉基因植株與對照植株之間存在生長速度及株型上的明顯差異，但在轉基因煙草株系莖和葉片中均檢測到低水平的表達，說明4XD病原誘導啟動元件在其他器官中仍具有部分表達活性。通過研究不同調控元件排列順序對表達特異性的影響，降低病原誘導啟動元件在非目的器官中的表達水平仍需要進一步的研究。此外，在轉基因大豆中，該策略是否對農藝性狀產生不良影響還需要進一步的大豆穩定轉化驗證，并且需要選擇更多的抗性基因進行評價。雖然如此，本研究為通過基因工程手段培育大豆抗疫霉根腐病品種進行了有益探索，提出一個精準調控抗性基因表達的可行思路。

4 結論

大豆是一個根特異性啟動子，166 bp長度的L5片段為控制根特異表達的關鍵片段。融合誘導性和根特異性核心元件的人工啟動子p4XD-L5能夠驅動目的基因在根中高效表達，該人工啟動子可作為轉基因大豆根腐病改良中調控轉基因時空特異表達的候選遺傳操作元件。

[1] TYLER B M.: root rot pathogen of soybean and model oomycete. Molecular Plant Pathology, 2007, 8(1): 1-8.

[2] 王桂榮, 王源超, 楊光富, 王燕, 周雪平. 農業病蟲害綠色防控基礎的前沿科學問題. 中國科學基金, 2020, 34(4): 374-380.

WANGG R, WANGY C, YANGG F, WANGY, ZHOU X P. Frontiersinscientificissuesofcontrollingagriculturalpestsand diseasesbyenvironmental-friendly methods. Bulletin of National Natural Science Foundation of China, 2020, 34(4): 374-380. (in Chinese)

[3] 張杰, 董莎萌, 王偉, 趙建華, 陳學偉, 郭惠珊, 何光存, 何祖華, 康振生, 李毅, 彭友良, 王國梁, 周雪平, 王源超, 周儉民. 植物免疫研究與抗病蟲綠色防控: 進展、機遇與挑戰. 中國科學: 生命科學, 2019, 49(1): 1479-1507.

ZHANG J, DONG S M, WANG W, ZHAO J H, CHEN X W, GUO H S, HE G C, HE Z H, KANG Z S, LI Y, PENG Y L, WANG G L, ZHOU X P, WANG Y C, ZHOU J M. Plant immunity and sustainable control of pests in China: Advances, opportunities and challenges. Scientia Sinica (Vitae), 2019, 49(1): 1479-1507. (in Chinese)

[4] FFRENCH-CONSTANT R H, BASS C. Does resistance really carry a fitness cost? Current Opinion in Insect Science, 2017, 21: 39-46.

[5] GURR S J, RUSHTON P J. Engineering plants with increased disease resistance: how are we going to express it? Trends in Biotechnology, 2005, 23(6): 283-290.

[6] HERNANDEZ-GARCIA C M, FINER J J. Identification and validation of promoters and-acting regulatory elements. Plant Science, 2014, 217-218: 109-119.

[7] KUMMARI D, PALAKOLANU S R, KISHOR P B K, BHATNAGAR- MATHUR P, SINGAM P, VADEZ V, SHARMA K K. An update and perspectives on the use of promoters in plant genetic engineering. Journal of Biosciences, 2020, 45(1): 119.

[8] LI Y Y, LI C X, CHENG L Z, YU S S, SHEN C J, PAN Y. Over- expression ofunder a rice root specific promoter. Plant Physiology and Biochemistry, 2019, 136: 52-57.

[9] KASUGA M, MIURA S, SHINOZAKI K, YAMAGUCHI- SHINOZAKI K. A combination of theDREB1A gene and stress-induciblepromoter improved drought- and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant and Cell Physiology, 2004, 45(3): 346-350.

[10] LILLEY C J, WANG D, ATKINSON H J, URWIN P E. Effective delivery of a nematode-repellent peptide using a root-cap-specific promoter. Plant Biotechnology Journal, 2011, 9(2): 151-161.

[11] HUANG L Y, ZHANG F, QIN Q, WANG W S, ZHANG T, FU B Y. Identification and validation of root-specific promoters in rice. Journal of Integrative Agriculture, 2015, 14(1): 1-10.

[12] CHEN L, JIANG B J, WU C X, SUN S, HOU W S, HAN T F.promoter drives root-preferential expression in transgenicand soybean hairy roots. BMC Plant Biology, 2014, 14: 245.

[13] CHEN L, JIANG B J, WU C X, SUN S, HOU W S, HAN T F. The characterization of, a root-specific gene from soybean, and the expression analysis of its promoter. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2015, 121(2): 259-274.

[14] 柴春月. 大豆中疫霉誘導性啟動子的克隆與功能研究[D]. 南京: 南京農業大學, 2013.

CHAI C Y. Identification and functional characterization of the soybean promoters conferringinduced expression[D]. Nanjing: Nanjing Agriculture University, 2013. (in Chinese)

[15] CHEN C J, CHEN H, ZHANG Y, THOMAS H R, FRANK M H, HE Y H, XIA R. TBtools: An integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data. Molecular Plant, 2020, 13(8): 1194-1202.

[16] YANG B, YANG S, GUO B, WANG Y, ZHENG W, TIAN M, DAI K, LIU Z, WANG H, MA Z, WANG Y, YE W, DONG S, WANG Y. Theeffector Avh241 interacts with host NDR1-like proteins to manipulate plant immunity. Journal of Integrative Plant Biology, 2021, 63(7): 1382-1396.

[17] YAN Q, SI J R, CUI X X, PENG H, JING M F, CHEN X, XING H, DOU D L., a conserved defender against cell death 1 (DAD1) from soybean, positively regulates plant resistance againstpathogens. Frontiers in Plant Science, 2019. 10: 107.

[18] HORSCH R B, ROGERS S G, FRALEY R T. Transgenic plants. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 1985, 50: 433-437.

[19] 李濯雪, 陳信波. 植物組織特異性啟動子及相關順式作用元件研究進展. 生物學雜志, 2015, 32(6): 91-95.

LI Z X, CHEN X B. Research advances in plant tissue specific promoters and related-acting elements. Journal of Biology, 2015, 32(6): 91-95. (in Chinese)

[20] KOPRIVOVA A, SCHUCK S, JACOBY R P, KLINKHAMMER I, WELTER B, LESON L, MARTYN A, NAUEN J, GRABENHORST N, MANDELKOW J F, ZUCCARO A, ZEIER J, KOPRIVA S. Root-specific camalexin biosynthesis controls the plant growth- promoting effects of multiple bacterial strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2019, 116(31): 15735-15744.

[21] WERNER T, NEHNEVAJOVA E, KOLLMER I, NOVAK O, STRNAD M, KRAMER U, SCHMULLING T. Root-specific reduction of cytokinin causes enhanced root growth, drought tolerance, and leaf mineral enrichment inand tobacco. The Plant Cell, 2010, 22(12): 3905-3920.

[22] JEONG H J, JUNG K H. Rice tissue-specific promoters and condition-dependent promoters for effective translational application. Journal of Integrative Plant Biology, 2015, 57(11): 913-924.

[23] KOEHORST-VAN PUTTEN H J J, WOLTERS A M A, PEREIRA- BERTRAM I M, VAN DEN BERG H H J, VAN DER KROL A R, VISSER R G F. Cloning and characterization of a tuberous root- specific promoter from cassava (Crantz). Planta, 2012, 236(6): 1955-1965.

[24] LI Y, LIU X Q, CHEN R M, TIAN J, FAN Y L, ZHOU X J. Genome-scale mining of root-preferential genes from maize and characterization of their promoter activity. BMC Plant Biology, 2019, 19(1): 584.

[25] ZHANG Q Q, GUO N N, ZHANG Y H, YU Y B, LIU S Y. Genome-wide characterization and expression analysis of Pathogenesis- Related 1 (PR-1) gene family in tea plant ((L.) O. Kuntze) in response to blister-blight disease stress. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(3): 1292.

[26] ALMEIDA-SILVA F, VENANCIO T M. Pathogenesis-related protein 1 (PR-1) genes in soybean: Genome-wide identification, structural analysis and expression profiling under multiple biotic and abiotic stresses. Gene, 2022, 809: 146013.

[27] HAN J H, LEE J H, LEE O R. Leaf-specific pathogenesis-related 10 homolog, PgPR-10.3, showsbinding affinity with several biologically important molecules. Journal of Ginseng Research, 2015, 39(4): 406-413.

[28] MYLONA P, MOERMAN M, YANG W C, GLOUDEMANS T, VANDEKERCKHOVE J, VANKAMMEN A, BISSELING T, FRANSSEN H J. The root epidermis-specific pea gene RH2 is homologous to a pathogenesis-related gene. Plant Molecular Biology, 1994, 26(1): 39-50.

[29] MOLINA A, GRLACH J, VOLRATH S, RYALS J. Wheat genes encoding two types of PR-1 proteins are pathogen inducible, but do not respond to activators of systemic acquired resistance. Molecular Plant-Microbe Interactions, 1999, 12(1): 53-58.

[30] LEON-KLOOSTERZIEL K M, VERHAGEN B W, KEURENTJES J J, VANPELT J A, REP M, VANLOON L C, PIETERSE C M. Colonization of therhizosphere by fluorescentspp. activates a root-specific, ethylene-responsivegene in the vascular bundle. Plant Molecular Biology, 2005, 57(5): 731-748.

[31] XU P F, JIANG L Y, WU J J, LI W B, FAN S J, ZHANG S Z. Isolation and characterization of a pathogenesis-related protein 10 gene () with induced expression in soybean () during infection with. Molecular Biology Reports, 2014, 41(8): 4899-4909.

[32] 崔文文, 遲婧, 馮艷芳, 耿麗麗, 劉榮梅. 人工合成根特異啟動子SRSP的功能分析. 生物工程學報, 2020, 36(4): 700-706.

CUI W W, CHI J, FENG Y F, GENG L L, LIU R M. Construction and function of a root-specific promoter SRSP. Chinese Journal of Biotechnology, 2020, 36(4): 700-706. (in Chinese)

[33] ZHONG R Q, DEMURA T, YE Z H. SND1, a NAC domain transcription factor, is a key regulator of secondary wall synthesis in fibers of. The Plant Cell, 2006, 18(11): 3158-3170.

[34] KO J H, KIM W C, HAN K H. Ectopic expression ofidentifies transcriptional regulatory genes involved in secondary wall biosynthesis in. The Plant Journal, 2009, 60(4): 649-665.

[35] SONG X G, MENG X B, GUO H Y, CHENG Q, JING Y H, CHEN M J, LIU G F, WANG B, WANG Y H, LI J Y, YU H. Targeting a gene regulatory element enhances rice grain yield by decoupling panicle number and size. Nature Biotechnology, 2022, 40(9): 1403-1411.

[36] WHITHAM S A, QI M, INNES R W, MA W, LOPES-CAITAR V, HEWEZI T. Molecular soybean-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology, 2016, 54: 443-468.

2023年全國畜牧獸醫期刊征訂目錄

序號期刊名稱郵發代號刊期年定價/元聯系人電話地址郵編E-mail 16飼料博覽14-184雙月刊90.00 倪樹森0451-55190639黑龍江省哈爾濱市香坊區東北農業大學內150030slbl@vip.163.com 17獸醫導刊（上半月）80-328半月刊150.00 趙 曉13520538616北京市朝陽區麥子店街20號農業農村部北辦公區001室100125sydk2007@263.net 18經濟動物學報自辦發行季刊100.00 劉兆娟0431-84533130 吉林省長春市新城大街2888號吉林農業大學130118jjdwxb@163.com 19廣東飼料自辦發行月刊120.00 周風珍020-37288820廣東省廣州市天河區先烈東路135號4號樓609室510500gdfeed@vip.163.com 20Journal of Animal Science and Biotechnology自辦發行雙月刊600.00 劉 萍010-62734403北京市海淀區圓明園西路2號中國農業大學動物科技學院154室100193jasbeditor@gmail.com 21中國獸醫科學54-33月刊180.00 張文舉0931-8342195 0931-8310086甘肅省蘭州市鹽場堡徐家坪1號730046zgsykx@zgsykx.com 22中國獸醫雜志2-137月刊240.00 黃長欽010-62733040北京市海淀區圓明園西路2號中國農大動物醫學院100193vetzzhi@cau.edu.cn 23中國乳業82-764月刊240.00 張愛華010-82106274北京市海淀區中關村南大街12號100081zhgry@caas.cn 24中國豬業80-493雙月刊180.00 張愛華010-82106274北京市海淀區中關村南大街12號100081zhuye@caas.cn 25中國牛業科學52-113雙月刊72.00 張 琪029-87091423陜西楊凌西北農林科技大學動物科技學院712100Huangn2002813@aliyun.com 26動物醫學進展52-60月刊180.00 黃建文029-87092574陜西楊凌西北農林科技大學動物醫學院712100dyjzyilan@263.net 27家畜生態學報52-112月刊72.00 陳小強029-87091130陜西楊凌西北農林科技大學動物科技學院712100jcst@x263.net 28畜牧產業82-612月刊180.00 黃 偉010-62123852北京市海淀區中關村南大街12號農科院飼料所輔助樓504100081xmcy@caaa.cn 29畜牧與飼料科學16-101雙月刊90.00 趙俊利0471-5294608內蒙古呼和浩特市昭君路22號內蒙古農牧業科學院010031cnmxky@vip.163.com

Identification of the root-specific soybeanpromoter and application inroot-rot resistance

YAN Qiang, XUE Dong, HU YaQun, ZHOU YanYan, WEI YaWen, YUAN XingXing, CHEN Xin

Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014

【Objective】The objective of this study is to identify the root-specific promotors and the core regulatory sequence of soybean. Then evaluate the potential application of the synthetic promoter inroot-rot resistance.【Method】The genes which specifically expressed in roots with high expression levels were screened based on the transcriptome date of soybean root, stem and leaf tissues in the seedling stage. Based on the distribution of theelements, the promoter truncation approach was used to map the minimal promoter controlling root specific expression in soybean hairy roots. The obtained minimal promoter fragment was concatenated with theinducible promoter elements p4XD to construct the synthetic promoter. The synthetic promoter driven over-expression ofresistance related genein soybean hairy roots, then the resistance level of transgenic tissue toand the expression profiles ofduring the interaction had been analyzed. Furthermore, the transgenicplants were generated to evaluate the resistance at plant level. 【Result】Though screening, six soybean PR1 homologues with significant root specific expression manner were identified, andhad the highest promoter activity. Numbers of root specific expression relatedelements were identified in promoter sequence using the online tool PLACE. Truncation analysis of the promoter showed that serial 5’ end deletions L1, L2, L3, L4 and L5 had different GUS activities. The L5 (-166 to -1) fragment had 80% activity of the full-length promoter, and was able to driveexpression in roots of transgenic. GUS enzyme activity was almost undetectable in three 3’ end deletions R1, R2 and R3, and the double terminal deletion mutant M1. When the fusion promoter p4XD-L5 drivenexpression in soybean hairy roots, the resistance towas significantly enhanced. The disease severity and lesion length were significantly reduced in the over-expression hairy roots when compared with control, and the relative biomass of Phytophthora decreased by 66.5% at 48 h post inoculation.maintained high expression level in over-expression tissues, with 39.2 times of that in control tissues. The expressions were further up-regulated after inoculation, and reached the highest level at 36 h. In p4XD-L5::NDR1 transgenicplants, the expression ofwas significantly higher in roots than that in stems and leaves. Fifteen days afterinoculation, the plant height, root length and fresh weight ofover-expression plants were significantly higher, and meanwhile the leaf wilting rate and lesion length were significantly lower. 【Conclusion】This study obtained a soybean root specific promoter and identified the core regulation sequence. The strategy which driven the expression ofby the synthetic promoter p4XD-L5 combined theinducible and tissue-specific promoter core elements can significantly enhance the resistance of transgenic soybean hairy roots andplantstopathogens.

soybean (); root specific promotor;; synthetic promoter;root-rot resistance

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.20.002

2022-05-05；

2022-06-27

江蘇省農業科技自主創新資金（CX（20）3119）、國家自然科學基金（32101668）、江蘇省特糧特經產業技術體系集成創新中心（[2021]423）

閆強，E-mail：yanqiang@jaas.ac.cn。通信作者陳新，E-mail：cx@jaas.ac.cn

（責任編輯 李莉）