紫外法和皮粉法測定塔拉單寧含量的對比研究

湯麗華， 張亮亮, 張 禾

(中國林業科學研究院 林產化學工業研究所；江蘇省生物質能源與材料重點實驗室；國家林業和草原局林產化學工程重點實驗室；林木生物質低碳高效利用國家工程研究中心；江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心，江蘇 南京 210042)

單寧在制藥、生化、日化、食品以及精細化工等高科技領域具有廣闊的應用前景，市場上供不應求[1-3]。目前市場上的單寧產品主要有五倍子單寧、塔拉單寧、栗木單寧等[4-5]。我國是五倍子單寧主要生產國，五倍子對生長環境有一定的條件要求，主要種植于我國的西南方[6]。塔拉單寧與五倍子單寧同屬于沒食子單寧，主要存在于塔拉果莢中，塔拉粉含單寧50%左右[7-8]。目前，我國每年可供加工利用的五倍子原料在9 000噸左右，而從秘魯等南美國家進口的塔拉粉產品超過2萬噸/年，塔拉粉已超過五倍子成為植物單寧加工的主要原料。塔拉樹生命力頑強，對生長條件要求沒有五倍子高，種植范圍廣，產量大，塔拉單寧與五倍子單寧有相似的結構，工業上可被用來替代五倍子作為生產沒食子酸、單寧酸等產品的原料[9-11]。

單寧酸檢測方法很多，有皮粉法、紫外分光光度法、高效液相法、氣相色譜法等[12]。而不同的檢測方法對不同的單寧酸產品的靈敏度和穩定性存在一定的差異性。高效液相法與氣相色譜法雖可檢測單寧酸，但至今沒有完善的國家標準，測定不同單寧酸產品時，需要對流動相、配比、流速、柱溫等條件進行相應的選擇。紫外法(LY/T 1642—2005，GB/T 27985—2011)與皮粉法(LY/T 1082—2008)雖有行業標準，但主要適用于五倍子單寧。由于目前塔拉單寧分析沒有統一的行業標準和國家標準，大多數企業采用紫外法對塔拉單寧含量進行測定，但由于塔拉單寧與五倍子單寧在化學結構上存在一定的差異，利用紫外法測定塔拉單寧含量所得數值普遍偏低；而皮粉法測定操作耗時比較長，步驟非常繁瑣，對實驗人員要求較高[13-15]。因此，本研究對5種不同含量的塔拉單寧分別用紫外法與皮粉法進行單寧含量測定，并進行對比研究，獲得紫外法測定塔拉單寧含量計算公式中的矯正常數，以期為制定紫外法測定塔拉單寧分析試驗方法提供依據。

1 實 驗

1.1 材料試劑與儀器

塔拉單寧樣品：本實驗室自行制備高純度塔拉單寧樣品記為T1；五峰赤誠生物科技股份有限公司提供樣品記為T2、T3；張家界久瑞生物科技有限公司提供樣品記為T4；四川亭江新材料股份有限公司提供樣品記為T5。五倍子單寧酸標樣(純度≥99%)、鉻皮粉(吸收單寧能力≥0.060 g/g)，均由實驗室自行制備，所用水為一級水，其余試劑均為市售分析純。

UV/VIS Agilent Technologies carry 8454型紫外-可見分光光度計，美國安捷倫公司；LC-20A液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 塔拉單寧含量測定

1.2.1紫外法 依據《單寧酸分析試驗方法》(LY/T 1642—2005)[16]進行紫外法分析試樣中單寧含量，實驗中做平行樣，誤差≤0.7%，取平均值。單寧酸(X1)計算公式如下：

(1)

式中：X1—紫外法測塔拉單寧中單寧酸質量分數，%;A0—塔拉單寧樣品溶液的吸光度；A1—單寧酸標準樣品溶液的吸光度；A2—經鉻皮粉吸附后塔拉單寧溶液的吸光度；m1—單寧酸標準品質量，g；m0—塔拉單寧質量，g。

1.2.2皮粉法 依據《栲膠分析試驗方法》(LY/T 1082—2008)[17]進行皮粉法分析試樣中單寧含量，實驗中做平行樣，當單寧的量≥33%，且重復實驗結果誤差≤1.0%，取平均值。單寧酸(X2)計算公式如下：

(2)

式中： 20—定容體積與取樣體積的比值；X2—皮粉法測塔拉單寧中單寧酸質量分數，%； 1.2—稀釋液與原液的體積比值；m2—可溶物質量，g；m3—50 mL可溶物中非單寧質量，g；m4—鉻皮粉空白殘渣質量，g；m0—塔拉單寧的質量，g；w0—塔拉單寧含水量，%； 0.075—鉻皮粉空白試驗的容許修正值，g/L。

1.3 結構表征

1.3.1紫外-可見吸收光譜分析 分別將塔拉單寧T1與五倍子單寧溶解于甲醇中，均配成質量濃度為1 g/L 的甲醇溶液。選擇T1是因為它純度高，更為準確。利用紫外-可見分光光度計在波長200～450 nm范圍內進行紫外光譜掃描。

1.3.2HPLC分析 色譜條件：色譜柱ODS C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流動相為A-B混合液，其中，A為甲醇(含0.1%三氟乙酸)，B為水(含0.1%三氟乙酸)。梯度洗脫：0～3 min, 10%A，90%B；3～25 min, 10%～30%A,90%～70%B；25～50 min, 30%～80%A,70%～20%B；50～55 min, 80%～10%A,20%～90%B；55～60 min, 10%A,90%B。流速：1.0 mL/min；測試液質量濃度：1 g/L(溶于甲醇)；檢測波長：280 nm；色譜柱溫度：28～32 ℃；進樣量：5～15 μL。

1.4 數據處理

試驗均重復進行3次，結果采用平均值±標準差表示。數據分析通過SPSS軟件完成，利用One-way ANOVA方法進行顯著性檢驗。

2 結果與討論

2.1 紫外法和皮粉法測定塔拉單寧含量對比分析

紫外法和皮粉法測定5種塔拉單寧含量的對比分析見表1。從表1可知，利用One-way ANOVA方法對單寧含量結果數值的顯著性檢測發現：高純度的塔拉單寧(93%)用紫外法和皮粉法檢測結果并無顯著性差異(P>0.05)，而純度60%左右的塔拉單寧在兩種方法中存在顯著性差異(P<0.05)，出現這兩種不同的現象可能是因為含60%的塔拉單寧不僅含有單寧，還含有其它多糖等雜質，這些雜質也可以與蛋白質進行結合，加大了絡合前后的質量差，而皮粉法主要就是利用重量法進行測定，故導致皮粉法測量值偏高。提純后的塔拉單寧因含多糖等雜質的量較低，所以高純度的塔拉單寧用皮粉法和用紫外法所測得的數值偏差不大。若不考慮多糖的影響，2種方法得到的結果以皮粉法為準。

表1 紫外法和皮粉法測定5種塔拉單寧1)

由于塔拉單寧T2～T5在皮粉法和紫外法中存在顯著性差異，故對這4種塔拉單寧在2種測量方法下的數值進行對比分析，經計算機軟件SPSS計算可得皮粉法測定數值是紫外法測定數值的1.03倍，得出皮粉法和紫外法測定4種樣品的平均值分別為62.213%±2.519%、 60.475%±2.691%，故而計算出紫外法測定塔拉單寧含量計算公式中的矯正常數p為1.03。即得到利用紫外法測定塔拉單寧含量矯正計算公式(式(3))：

(3)

式中：w1—試樣干燥損失的質量分數，%； 1.03—矯正常數。

2.2 結構表征

2.2.1紫外-可見吸收光譜分析 分別用甲醇配制1 g/L的T1塔拉單寧與五倍子單寧溶液，進行紫外光檢測。塔拉單寧與五倍子單寧的紫外-可見吸收光譜見圖1。從圖可以看出，在紫外-可見吸收光譜中塔拉單寧T1與五倍子單寧的最大吸收峰均為276 nm，這是由于塔拉單寧與五倍子單寧結構上存在類似的多酚結構，在276 nm處具有特定的紫外吸收。這也是紫外法測定塔拉單寧含量將紫外分光光度計波長設置在276 nm處的原因。此外，由圖1可知，同濃度下的塔拉單寧在276 nm處的吸收峰比五倍子單寧的吸收峰要高，該位置的吸收峰主要受苯環影響，HPLC譜圖(圖2)中可明顯看到五倍子單寧主體出峰位置靠后，這說明五倍子單寧的平均分子質量要比塔拉單寧的平均分子質量大，也就是說相同質量濃度下所含的塔拉單寧的分子個數要比五倍子單寧的分子個數多。因此，在相同質量濃度時塔拉單寧所含的苯環的數量更多，塔拉單寧的吸光度比五倍子單寧的吸光度要高。

圖1 單寧的紫外-可見吸收光譜Fig.1 The UV-Vis absorption spectra of tannin

2.2.2HPLC分析 5種塔拉單寧與五倍子單寧的HPLC譜圖見圖2。從圖2可知，在1.3.2節色譜條件下，塔拉單寧成分出峰時間主要在20～40 min，而五倍子單寧成分出峰時間主要在30～45 min。導致這一現象的主要原因是塔拉單寧與五倍子單寧在化學結構上存在一定的差異，塔拉單寧分子主要是由奎寧酸通過酯鍵連接沒食子酸構成，而五倍子單寧分子則是由葡萄糖通過酯鍵連接沒食子酸構成[18]。

塔拉單寧tara tannin: a.T1; b.T2; c.T3; d.T4; e.T5; f.五倍子單寧Chinese gallnut tannin

3 結 論

3.1采用紫外法和皮粉法對5種塔拉單寧進行對比分析，并用One-way ANOVA方法進行顯著性檢驗分析，結果表明：高純度的塔拉單寧(93%)在2種測試方法中無顯著差異(P>0.05)，而純度60%左右的4種塔拉單寧在2種測試方法間存在顯著性差異(P<0.05)，塔拉單寧的測定結果以皮粉法為準，通過SPSS軟件可計算出紫外法測定塔拉單寧含量計算公式中的矯正常數p為1.03。

3.2紫外-可見吸收光譜分析表明：塔拉單寧和五倍子單寧的最大吸收峰均為276 nm，同質量濃度下塔拉單寧的吸收峰強度高于五倍子單寧。HPLC分析表明：塔拉單寧成分出峰時間主要在20～40 min，而五倍子單寧成分出峰時間主要在30～45 min。