嘔吐毒素檢測測量系統分析

韋 冰，陳艷熙，覃均生

（南寧學院，廣西南寧 541699）

嘔吐毒素是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等真菌的次生代謝物，過量攝入會激發嘔吐、腹瀉、腸胃不適、抑制免疫系統等毒性效應。多個物種尤其豬對其毒性非常敏感。對生長育肥豬而言，當飼料中含有12～14 mg/kg 嘔吐毒素，進食后10～20 min 即會使豬出現嘔吐、不正常的焦慮、磨牙現象，當食物中嘔吐毒素含量超過19 mg/kg，豬拒絕采食（黃凱等，2013）。國標GB 13078—2017《飼料衛生標準》規定，植物性飼料原料中嘔吐毒素限量≤5 mg/kg。近年來的研究表明，人類患IgA 腎病和嘔吐毒素攝入有關（張海濤等，2021）。因此，不論是飼料原料還是飼料成品，嘔吐毒素含量都是養殖行業的必檢項目。

根據GB13078—2017，飼料原料、成品均應按照GB/T 30956—2014《飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定 免疫親和柱凈化—高效液相色譜法》中介紹的高效液相色譜法進行檢測。該檢測方法的準確性和可靠性毋庸置疑，但該方法檢測成本高，檢測時間為2～4 h（時間過長），試驗操作對實驗人員的素質要求高等缺點都不適宜在企業進行頻繁、大批量的樣品檢測。

隨著研究的深入和科技的發展，嘔吐毒素檢測方法也在不斷更迭換代。羅俊聰和李浩坤（2014）將ELISA 試劑盒法與高效液相色譜法進行對比，發現兩者的回收率相差不大，且ELISA試劑盒法要比高效液相色譜法樣品前處理時間更短、檢測時間更短、試驗成本更低等優勢。李小明等（2017）將便攜式真菌毒素快速定量檢測儀和酶聯免疫法用于檢測玉米中的嘔吐毒素含量，以得到快速定量檢測儀的檢出限。何詠怡等（2021）為了解市售嘔吐毒素酶聯免疫吸附試劑盒質量情況，選取了兩款市售嘔吐毒素酶聯免疫吸附試劑盒進行性能研究，結果表明，兩款試劑盒的檢出限、量限、回收率、復性和一致性均能滿足國內對玉米中嘔吐毒素的檢測要求。

以上現有研究均是對檢測嘔吐毒素測量方法的性能進行對比分析，但對檢測嘔吐毒素測量系統分析的研究尚未有報道。測量系統是指得到測量結果過程中所有操作人員、測量儀器、設備、環境、軟件等因素。而測量系統分析則是測量系統評估工具。測量系統分析被廣泛應用于汽車制造等領域（孫國峰等，2022；鄭曉峰等，2022；張婭嵐等，2021；馬麗莎，2021；潘濤等，2021；韋永寅，2021；王海龍等，2020；陶明東和周夢璐，2020；Muhammad 等，2020），用以確保測量數據的質量。本研究對飼料企業常用的兩種檢測嘔吐毒素方法-ELISA 試劑盒法和上轉發光法的測量系統進行分析（樣品前處理使用的電子分析天平、粉碎機、振蕩器、離心機均為相同儀器），一方面，為了檢測現階段測量數據的可靠性，另一方面，通過對比分析選擇其中更為合適的檢測方法，為相關企業選擇檢測嘔吐毒素方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 某飼料生產公司購入的轉基因玉米[ 嘔吐毒素含量要求（0.22±0.03）mg/kg、高粱（0.46±0.03）mg/kg、進口玉米（0.87±0.03）mg/kg、玉米蛋白粉（1.90±0.03）mg/kg、國產安徽玉米（2.20±0.03）mg/kg]等植物性飼料原料，經過粉碎、振蕩及離心后的待測液。

水為GB/T 6682 規定的二級水。

1.2 儀器與設備 食品安全快速檢測儀：北京熱景生物技術股份有限公司制造，儀器型號為UPT-3A-1800-5，生產日期為2021年8月26日（儀器有效使用期限為5年），輸入電源條件為100—240VAC、50/60 Hz、1.0 A。

定量條：北京熱景生物技術股份有限公司生產，批號為20211003，實驗中使用的定量條均為同一生產廠家、同一生產批號，與食品安全快速檢測儀配套使用。

酶聯競爭免疫分析儀：賽默飛世爾（上海）儀器公司的Multiskan FC 型酶標儀，最大輸入功率為100 VA。

試劑盒：河北伊萊莎生物技術有限公司生產，生產批號為20018H-2，試驗中使用的試劑盒均為同一生產廠家、同一生產批號。

數據分析軟件采用Minitab 18。

1.3 試驗方法

1.3.1 上轉發光法 （1）對樣品進行前處理。粉碎樣品（樣品粉碎程度達到90% 過30 目篩），稱量（2±0.2）g 粉碎后的樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 蒸餾水，放入振蕩器中振蕩15 min，取出離心管并轉移至離心機中離心5 min，小心取出，勿使溶液渾濁。

（2）確認當前檢測環境溫度為20～25℃，移取700μL 樣本稀釋液于2 mL 小離心管中。

（3）移取100μL 樣液于已有草本稀釋液的小離心管中，混勻，為待測液。

（4）使用移液槍吸取待測液100μL 于定量條的反應孔中，等待反應15 min。

（5）使用食品安全快速檢測儀讀取定量條中的一維碼后，將定量條插入食品安全快速檢測儀口中，食品安全快速檢測儀進行讀數并輸出結果。

1.3.2 ELISA 試劑盒法 （1）對樣品進行前處理。粉碎樣品（樣品粉碎程度達到90% 過30 目篩），稱量（2±0.2）g 粉碎后的樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 蒸餾水，放入振蕩器中振蕩15 min，取出離心管并轉移至離心機中，離心5 min，小心取出，勿使溶液渾濁。

（2）試劑盒回溫后將100μL 酶標記物加入到混合孔中。

（3）將50μL 標準品或樣品分別加入每個混合孔中，混勻，用移液槍吸取100μL 混合孔中的液體轉移至對應的試驗孔中（酶標板），注意防止污染。

（4）20～25℃的溫度下反應10 min。

（5）清洗液洗板。

（6）在每個試驗孔中加入100μL 底物溶液，使其顯色后，在20～25℃的環境下再反應5 min。

（7）在每個試驗孔中加入100μL 終止液，延緩試驗孔中溶液的反應速度。

（8）使用450 nm 酶標儀讀取吸光度值，在小蜜蜂軟件中輸入對應吸光度值，輸出結果。

1.3.3 測量系統分析方法 上轉發光法和ELISA試劑盒法兩個測量系統的分辨力、穩定性、偏倚、線性、重復性和再現性研究方案設計要點如表1所示。

表1 兩個測量系統分析方案設計要點

2 結果與分析

2.1 分辨力 可接受的分辨力應小于制造過程變差或公差的十分之一（楊朝盛，2020；克萊斯勒集團公司等，2010；呂瑩，2017）。

酶標儀的測量分辨力為0.00001 mg/kg，食品安全快速檢測儀的測量分辨力為0.01 mg/kg。根據以往試驗，飼料原料嘔吐毒素含量為0.2～2.5 mg/kg，表明這兩個測量系統的分辨力都滿足檢測要求。相比而言，ELISA 試劑盒法的分辨力更優于上轉發光分析法。

2.2 穩定性 穩定性是測量系統分析的前提條件之一。本研究采用均值- 極差控制圖分別對ELISA 試劑盒法、上轉發光分析法測量系統進行穩定性分析，結果如圖1所示。

極差圖和均值圖均無異常點，處于統計受控狀態。因此，ELISA 試劑盒法、上轉發光分析法測量系統穩定性可以接受。

2.3 偏倚和線性 為提高試驗數據的使用率，降低試驗成本，將偏倚和線性進行聯合分析和討論。兩種方法的測量系統線性、偏倚分析結果如圖2、圖3所示。

由圖2可知，“偏倚=0”線被95% 的置信區間完全包含，P（斜率）=0.511＞0.05，P（常量）=0.7＞0.05，表明ELISA 試劑盒法測量系統不存在顯著線性差異。同時，P（平均偏倚）=0.115＞0.05，表明該測量系統不存在顯著偏倚誤差。同理，由圖3可知，上轉發光法測量系統線性和偏倚均在可接受范圍。

2.4 重復性和再現性 重復性和再現性實質分別反映的是設備變差和人變差。重復性和再現性通常聯合分析也稱為測量系統R&R 分析。ELISA 試劑盒法測量系統分析Minitab 輸出結果如表2、表3所示。

表2 ELISA 試劑盒法雙因子方差分析表

表3 ELISA 試劑盒法研究變異分析表

由表2、表3可知，ELISA 試劑盒法方差分析表，部件P 值小于0.05，是唯一影響測量誤差的顯著因子。研究變異分析表中，合計量具R&R 的“%研究變異（%SV）”即R&R% 為6.56%，“% 公差”即P/T% 為5.48%，均小于10%，表明該測量系統測量誤差在可接受范圍內。

由表4、圖4可知，上轉發光法合計量具R&R% 為37.12%，P/T% 為96.08%，均 大 于30%，同時可區分的類別數只有3，表明測量誤差過大，該測量系統不可接受。

表4 上轉發光法研究變異分析表

3 討論及結論

在ELISA 試劑盒法和上轉發光法測量系統分析中，分辨力、穩定性、偏倚和線性均滿足要求。但后者重復性和再現性（R&R%和P/T%）不可接受。主要原因在于上轉發光法所使用的食品安全快速檢測儀可視分辨力僅為0.01 mg/kg。其滿足“十分之一”法則，是基于常見多種飼料原料嘔吐毒素含量范圍（0.2～2.5 mg/kg）之上。但對于某種常用飼料原料，如轉基因玉米（0.22±0.03 mg/kg）、高粱（0.46±0.03 mg/kg）、進口玉米（0.87±0.03 mg/kg）、玉米蛋白粉（1.90±0.03 mg/kg）、國產安徽玉米（2.20±0.03 mg/kg）等，公差為0.06 mg/kg，食品安全快速檢測儀可視分辨力不符合十分之一法則要求。同時，在上轉發光法測量系統R&R 分析中，可區分的類別數NDC 不足5，即1.41σAct/σR&R＜5；均值控制圖未有50%以上的點超上下控制界限，R 圖極差個數僅有2 個，以上均表明了該方法的測量系統有效分辨力不足。

綜上研究，ELISA 試劑盒法測量系統誤差在可接受范圍內，測量數據相對準確、可靠。相比于上轉發光法，建議相關企業優先選擇ELISA 試劑盒法。

測量系統分析不僅能降低因測量不可靠導致的品質風險，避免成本浪費，還可提高顧客對組織的信任，提高客戶對品牌的信心。這也是測量系統分析目前能在越來越多領域得到深入推廣應用的原因。本研究將測量系統分析應用于飼料原料嘔吐毒素檢測中，豐富了測量系統分析的使用范圍，也為相關企業選擇嘔吐毒素檢測方法提供了參考。