益生菌對肉雞脾臟發育及淋巴細胞增殖的影響

張利衛，白欣潔，劉冠慧，張 曼，王 軍，彭永帥，李月勤，李 果，宋予震*

（1.河南牧業經濟學院動物醫藥學院，河南鄭州 450046；2.北京農業職業學院畜牧獸醫系，北京 102442；3.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038）

在畜牧生產中，抗生素的使用受到了限制，為了提高畜禽生產性能和免疫功能，新型替抗產品得到了人們的廣泛關注。益生菌能產生活性物質和抗菌物質，而這些產物在清除腸道致病菌，增強宿主腸道黏膜完整性等方面具有重要作用（Park等，2016；朱學泰，2007）。研究表明，復合益生菌制劑可以提高肉雞免疫功能，改善肉雞腸道菌群（謝文惠，2018；張曼等，2015）。付麗等（2015）研究表明，飼料中添加乳酸菌可以提高肉仔雞血清抗體水平。李可等（2015）研究發現，飼糧添加丁酸梭菌、屎腸球菌等菌類可提高AA 肉仔雞的免疫器官指數。另外，Wu 等（2010）發現，長雙歧桿菌有助于提高巨噬細胞的吞噬能力。益生菌能對機體免疫器官的生長發育產生一定的刺激，從而提高機體免疫水平（唐志剛等，2010）。肉雞免疫器官是機體實現免疫功能的組織者（郭欣怡等，2016）。研究表明，復合益生菌制劑能通過提高肉雞免疫器官指數來提高肉雞免疫功能（葉思霖等，2021；桂雪兒，2020）。但益生菌提高肉雞免疫器官指數的作用機制尚不明確。因此，本試驗研究益生菌對肉雞脾臟組織發育和淋巴細胞增殖的影響，確定益生菌影響肉雞脾臟免疫功能的作用途徑，從而為養禽業合理使用益生菌提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 動物飼養及取材 試驗將75 只1日齡雄性肉雞隨機分為A、B、C、D 和E 5 組，每組5 只，每組3 個重復。試驗組A、B、C、D 組分別添加不同益生菌（益生菌具體成分和添加量如下表1示），E 為空白對照組，飼喂基礎日糧。基礎日糧組成及營養水平見表2。其中益生菌A、益生菌B 和益生菌D 是固態益生菌，與飼料混合添加，益生菌C 是液態益生菌，稀釋于水中飲用。益生菌由河南金百合生物科技股份有限公司提供。自由飲水，自由采食。飼養至21 d 后處死，取其脾臟于福爾馬林中固定。

表1 益生菌成分及添加劑量

表2 基礎日糧組成及營養水平

1.2 石蠟切片制作 取出固定的脾臟組織進行脫水和石蠟包埋，制作5 μm 厚的石蠟切片。

1.3 HE 染色 HE 染色步驟：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，逐級酒精各3 min，蘇木素6 min，1% 鹽酸酒精10 s，自來水10 min，逐級酒精3 min，伊紅1 min，95% 乙醇I 3 min、100% 乙醇3 min，二甲苯Ⅰ 3 min、二甲苯Ⅱ 3 min，中性樹膠封片。

1.4 免疫組織化學染色 免疫組織化學染色步驟：二甲苯I 和II，各10 min，逐級酒精各3 min，修復液水浴18 min，溫度 95℃。冷卻至常溫，0.01 mol PBS 漂洗3 次，每次5 min，3% 過氧化甲醇避光20～30 min。0.01 mol PBS 漂洗3 次，每次5 min，5% 山羊血清37℃ 30 min，PCNA 一抗（1 ∶4000）4℃冰箱過夜，室溫40 min，0.01 mol PBS 漂洗3 次，每次5 min。生物素標記的二抗（羊抗兔IgG，1 ∶300），室溫2 h，PBS 漂洗3 次，每次5 min。滴加SABC 復合物，室溫2 h，PBS漂洗3 次，每次5 min。DAB 顯色液顯色，蒸餾水5 min，蘇木精染色液10 s。分色1.5 s，自來水沖洗10 min，蒸餾水3 min，逐級酒精各3 min，二甲苯I、二甲苯II 各5 min，中性樹膠封片。

1.5 數據統計分析 將HE 染色切片和免疫組織化學染色切片用生物顯微鏡進行觀察并拍照，用軟件ImageJ 統計各組脾小結面積、PCNA 免疫陽性細胞光密度和陽性細胞數量。各組數據用SPSS 26 進行顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 肉雞脾小結面積大小 由表3和圖1可知，A、B、C、D 組的脾小結面積比對照組分別增加30%（P＞0.05）、35.8%（P＞0.05）、60.97%（P＜0.05）和51.94%（P＜0.05）。這表明添加益生菌能促進肉雞脾臟、脾小結生長。

表3 21日齡肉雞脾臟PCNA 陽性細胞數量

表3 21日齡肉雞脾小結面積

2.2 肉雞脾臟PCNA 免疫陽性細胞數量 由表4和圖2可知，A、B、C、D 組脾臟PCNA 免疫陽性細胞數量比對照組免疫陽性細胞數量分別增加46.61%（P＜0.05）、35.55%（P＜0.05）、27.35%（P＜0.05）和38.67%（P＜0.05）。這表明添加不同益生菌均能顯著增加脾臟PCNA 陽性細胞數量。

2.3 肉雞脾臟PCNA 免疫陽性細胞光密度 由表5和圖2可知，A、B、C、D 組脾臟PCNA 免疫陽性細胞光密度比對照組免疫陽性細胞光密度分別顯著增加11.74%（P＜0.05）、12.52%（P＜0.05）、9.04%（P＜0.05）和8.57%（P＜0.05），表明添加不同益生菌能提高肉雞脾臟PCNA 免疫陽性細胞光密度。

表5 21日齡肉雞脾臟PCNA 陽性細胞光密度

3 討論

益生菌是一種微生態制劑，具有綠色、安全、無污染等優點。益生菌在肉雞生長性能和免疫強度提高方面發揮著重要作用。于明等（2021）研究表明，飼料中添加復合益生菌制劑能提高肉雞料重比，提高血清中IgA 和IgG 水平，增加盲腸有益菌群數量，從而提高肉雞免疫功能。李桂杰等（2000）研究表明，加酶益生素能明顯促進肉仔雞生長，提高飼料轉化率。

張利環等（2021）研究發現，益生菌能增強消化酶的分泌和活性，益生菌可以改善消化道形態，調節細胞膜GLUT2 過表達，促進營養物質轉運，從而提高肉雞生長性能。同樣，劉鳳美等（2018）研究發現，益生菌能提高肉雞生產性能、胸腺、脾臟和法氏囊指數，改善肉雞免疫抗病能力。本試驗也發現益生菌能通過增加脾小結的面積來促進脾臟發育。

益生菌可能通過促進免疫器官、淋巴細胞的增殖來提高肉雞的免疫功能。韓亞楠等（2021）發現，益生菌可以增強肉雞法氏囊的免疫功能，從而提高肉雞免疫力。本試驗結果表明，添加不同益生菌均能提高脾臟增殖淋巴細胞的數量和光密度，表明益生菌能提高免疫器官淋巴細胞的增殖。

4 結論

本試驗發現，與對照組相比，試驗組脾臟免疫陽性細胞數量和免疫陽性細胞光密度具有顯著差異，表明益生菌對肉雞脾臟發育和脾臟內淋巴細胞增殖具有一定的促進作用。