茶葉中真菌毒素檢測研究現(xiàn)狀

◎ 吳定芳，戴佩珍，何茫茫

（瑞安市食品檢驗檢測中心，浙江 瑞安 325204）

茶，是中華民族的舉國之飲，發(fā)于神農(nóng)，聞于魯周公，興于唐朝，盛于宋代。茶葉具有一定的保健功效，如興奮提神、利尿、止痢、預(yù)防便秘、防齲、助消化、明目、抗衰老、降血壓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、降血糖、抗癌和抗突變作用等[1]。飲茶已經(jīng)成為人們生活的一部分，除了水以外，茶是世界上消費最多的飲料之一。中國名茶種類繁多，其中像綠茶、紅茶和普洱茶等是最受國內(nèi)市場歡迎的茶葉品類[2]。然而，近年來頻頻流出普洱茶等經(jīng)過微生物發(fā)酵的茶葉存在真菌毒素污染的風(fēng)險，讓越來越多的飲茶者開始關(guān)注茶葉中真菌毒素污染的風(fēng)險情況。

真菌毒素是某些真菌在特定條件下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，不僅污染食品引起飲茶者食物中毒，有些真菌毒素還具有致癌、致畸、致突變以及引起中毒性腎損傷、干細(xì)胞毒性、免疫抑制和生殖紊亂等慢性毒害作用，對健康造成極大威脅[3-4]。目前發(fā)現(xiàn)的真菌毒素有400多種，包括黃曲霉毒素B族、黃曲霉毒素M族、黃曲霉毒素G族、伏馬菌素、赭曲霉素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T2毒素和桔青霉素[5-6]等，其中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等具有毒性較強(qiáng)、污染頻率較高的特點[6]。

近年來，隨著各種前處理技術(shù)的不斷發(fā)展，一些新興的材料被不斷開發(fā)，針對性更強(qiáng)、操作上更簡便的樣品前處理技術(shù)及檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品、茶葉、中藥和飼料中真菌毒素的研究[7-11]。

1 真菌毒素前處理技術(shù)

由于經(jīng)過粗略的提取，大部分目標(biāo)物和雜質(zhì)會共存于提取液中，這會干擾目標(biāo)物的檢測，也會對檢測設(shè)備造成污染和損害，因此為減少雜質(zhì)的干擾及對檢測設(shè)備的損害，前處理技術(shù)的完善和改進(jìn)在檢測中就顯得尤為重要。近年來，隨著一些新興的理念和新興的材料被不斷開發(fā)和應(yīng)用，出現(xiàn)了許多高效快速的樣品前處理方法。目前已被報道或取得廣泛應(yīng)用的前處理技術(shù)不斷被引入真菌毒素的檢測中，其中主要有固相萃取技術(shù)（Solid Phase Extraction，SPE）、QuEChERS技術(shù)、凝膠滲透色譜凈化等[8,11-12]。

1.1 固相萃取技術(shù)

固相萃取技術(shù)是近年來發(fā)展較好，應(yīng)用較多的一種樣品前處理技術(shù)，一般包括3個步驟，即活化、上樣、洗脫，將提取液通過柱子后，提取液中的目標(biāo)物被保留在柱中，通過選擇合適的溶劑把保留在柱子中的目標(biāo)物洗脫下來，從而達(dá)到分離、凈化的目的[13-14]。 與傳統(tǒng)的液-液萃取相比，SPE技術(shù)具有材料選擇性多、針對性強(qiáng)、回收率高、溶劑消耗少、操作簡便和更具環(huán)保性等優(yōu)點，這些優(yōu)點使得SPE技術(shù)廣泛應(yīng)用于真菌毒素的檢測[15]。在真菌毒素檢測的前處理中，用到最多的是多功能凈化柱和免疫親和柱等。曾濤等[16]利用多功能凈化柱對茶葉中黃曲霉毒素的碘柱后衍生化和光化學(xué)柱后衍生化-高效液相色譜法進(jìn)行比較。劉妍等[17]利用多功能凈化柱建立了5種真菌毒素簡單、快速超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。崔悅等[18]利用免疫親和柱凈化建立了光化學(xué)柱后衍生-高效液相色譜法同時測定茶葉中4種黃 曲霉毒素。

1.2 QuEChERS技術(shù)

QuEChERS是Quickly、Easy、Cheap、Effective、 Rugged和Safe這幾個英文單詞首字母的縮寫，該技術(shù)是以快速、簡便、低廉、有效、可靠和安全等特點著稱的。QuEChERS技術(shù)是在固相萃取技術(shù)和基質(zhì)分散固相萃取技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，主要依靠加在基質(zhì)里的固相吸附劑對非目標(biāo)化合物的吸附而達(dá)到凈化的目的。目前該技術(shù)被廣泛應(yīng)用在茶葉中真菌毒素的檢測中。劉妍等[19]利用QuEChERS凈化，成功建立發(fā)酵黑茶中10種真菌毒素簡單、快速、高靈敏度超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。

1.3 凝膠滲透色譜凈化

凝膠滲透色譜凈化是一種發(fā)展較早的前處理技術(shù)，其原理是根據(jù)凝膠的化學(xué)惰性即不具有吸附、分配和離子交換作用，從而在試樣通過時根據(jù)分子大小不同、洗脫速度不同達(dá)到去除樣品中的大分子物質(zhì)的目的。該法具有自動化程度高、凈化效果好、回收率高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點，但應(yīng)用性不是很廣。目前該技術(shù)應(yīng)用在茶葉中真菌毒素檢測的報道較少，可能跟茶葉中復(fù)雜的基質(zhì)有關(guān)，但應(yīng)用在食品中真菌毒素檢測的報道較多，如劉家陽等[20]通過凝膠滲透色譜凈化成功建立了玉米粉中10種真菌毒素簡單安全、成本低、快速準(zhǔn)確的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 檢測方法。

2 檢測方法

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展、檢測設(shè)備的更新迭代以及檢測人員素質(zhì)的不斷提高，真菌毒素的檢測技術(shù)也呈現(xiàn)出多元化的趨勢。目前常用的真菌毒素檢測方法有薄層色譜法[21]、氣相色譜法[22]、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法和酶聯(lián)免疫法[23]等。

2.1 薄層色譜法

薄層色譜法是根據(jù)真菌毒素大多水溶能力差的特點，用有機(jī)溶劑提取后使用展開劑展開，再用紫外燈或熒光燈觀察。該法對樣品預(yù)處理要求低，無需特殊儀器，實驗成本低廉，是快速檢測和定性分析的重要手段，但檢測精度有待加強(qiáng)，而且對檢測人員的檢測素質(zhì)要求較高。

2.2 氣相色譜法

氣相色譜法是以氣體為流動相，使用電子捕獲檢測器和質(zhì)譜檢測器來檢測真菌毒素，但存在真菌毒素高溫下不易氣化且較難找到衍生化試劑的問題，因而限制了該法的應(yīng)用，目前該方法很少被用于茶葉中真菌毒素的檢測。

2.3 液相色譜法

高效液相色譜法配紫外檢測器或熒光檢測器是檢測真菌毒素的常用方法，該法適用范圍廣，可對不易揮發(fā)不易氣化的真菌毒素進(jìn)行穩(wěn)定檢測。付朝暉等[24]利用超高效液相色譜法快速測定發(fā)酵茶葉中的4種黃曲霉毒素。崔悅等[18]利用高效液相色譜-熒光法同時測定茶葉中4種黃曲霉毒素。

2.4 液質(zhì)聯(lián)用法

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是以噴霧離子源和大氣壓化學(xué)電離源等接口技術(shù)將液相色譜和質(zhì)譜串聯(lián)起來作為整體使用的檢測技術(shù)。該技術(shù)具有液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)的優(yōu)點，一些在氣相色譜質(zhì)譜儀不能分析的熱不穩(wěn)定化合物、極性較大的化合物以及相對分子量較大的化合物可使用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有檢測靈敏度高、檢測范圍廣、結(jié)果可靠等優(yōu)點，是一種高效率、高可靠性的分析技術(shù)。王鷺等[25]建立了液質(zhì)聯(lián)用法同時檢測普洱茶、紅茶、綠茶中的8種真菌毒素，并且模擬實際的飲茶方法，準(zhǔn)確地檢測茶葉中進(jìn)入茶湯的真菌毒素。胡琳等[26]建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定普洱茶中16種真菌毒素。將QuEChERS前處理技術(shù)與液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合起來，越來越多被應(yīng)用于茶葉中多種真菌毒素的測定，擴(kuò)大了真菌毒素檢測的范圍。劉文靜等[27]將QuEChERS技術(shù)和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合起來，應(yīng)用于陳年老茶中16種真菌毒素殘留的檢測，大大提高了真菌毒素的檢測速度，擴(kuò)大了真菌毒素檢測的種類。

3 結(jié)語

總體而言，茶葉中真菌毒素的研究越來越趨向于液質(zhì)聯(lián)用法，并與QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合起來。然而，該設(shè)備較昂貴，一些基層檢測機(jī)構(gòu)未必都能配備。因此，基層檢測機(jī)構(gòu)在不具備液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀時，可以采用SPE前處理技術(shù)和液相色譜法開發(fā)茶葉中多種真菌毒素的檢測方法。