美拉德反應調控大豆蛋白功能性質的研究進展

◎ 薛 遠，宋春麗，任 健

（齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

食品蛋白質的糖基化修飾，是將親水性的糖類物質以共價鍵連接的方式連接到蛋白質分子之中，使其既具有蛋白質的大分子特性，又具有糖類物質的親水特性[1]。美拉德反應是在食品領域中對蛋白質進行改性時常用的技術手段。美拉德反應是蛋白質的游離氨基與還原糖的羰基共價交聯，產生糖基化蛋白質的過程[2]。本文對美拉德反應對大豆蛋白結構、功能性質的影響以及目前美拉德產物構效關系研究存在的局限性進行綜述，同時展望了該研究在食品加工中的應用前景。

1 美拉德反應機理

美拉德反應是食品加工中普遍存在的、涉及碳水化合物和蛋白質的一類非褐變反應，最初是由法國化學家Louis-Camille Maillard發現。該反應是蛋白質、肽或氨基酸的氨基與還原糖的羰基發生了縮合、降解、裂解等反應，席夫堿形成并重排為Amadori或Heyns產物，最后形成了大分子化合物類黑素，導致褐變[3]。糖基化反應過程主要由3個階段（早期、中期、晚期）構成，采用糖分子對蛋白質進行改性主要是基于美拉德反應早期的第一步，即還原糖的羰基和蛋白質的氨基發生共價交聯反應，生成糖基化蛋白質。美拉德反應產物的產量與種類主要受反應溫度、反應時間、pH以及氨基與糖基比等條件的影響，導致產物的理化性質、結構和功能性不同。

目前，美拉德反應分為干熱法和濕熱法。干熱法是最早制備蛋白質糖基化產物的方法之一，且具有無額外反應底物、易控制反應條件和高接枝度的優點。干熱法是先將蛋白質與糖分子混合溶液凍干，針對固體反應底物，在一定相對濕度和反應時間下進行高溫加熱，制備糖基化蛋白質。利用大豆蛋白與麥芽糊精作為底物，在90 ℃下進行干熱糖基化反應，制備大豆蛋白-麥芽糊精共聚物，結果表明干法美拉德反應能夠提高大豆蛋白的溶解性和乳化性等相關性質[4]。

濕熱法是最基礎的糖基化加工方法，濕熱法是蛋白質與糖分子的混合溶液在高溫下發生糖基化反應，凍干得到糖基化產物。濕熱法美拉德有利于蛋白質和糖分子之間的接觸發生反應，提高該反應的接枝度，從而對蛋白質的功能性質產生影響。利用大豆蛋白與杏鮑菇多糖在90 ℃條件下反應1 h，進行濕熱法美拉德反應，制備大豆蛋白-杏鮑菇多糖共聚物，結果表明糖基化后的大豆蛋白具有更好的溶解性和乳化性，能夠制備高穩定性的大豆蛋白-杏鮑菇多糖共聚物穩定乳劑[5]。

2 美拉德反應對大豆蛋白結構的影響

美拉德反應使大豆蛋白與還原糖發生共價交聯，能夠改變大豆蛋白的結構，進而對蛋白質的功能性質產生影響。

2.1 微觀結構

目前，測定蛋白質微觀結構的方法主要有掃描電子顯 微 鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）、透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）和激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM）。以大豆蛋白與麥芽糖為原料，進行美拉德糖基化反應制備糖基化產物，利用SEM檢測證實，糖基化產物的顆粒與大豆蛋白相比更加疏松、均勻且分子聚集性顯著降低[6]。采用大豆蛋白與大豆多糖制備多糖蛋白復合性乳液，利用TEM，發現復合乳液的乳液液滴分布均勻、顆粒大小均一，結果證明多糖增加了大豆蛋白的乳液穩定性[7]。利用CLSM分析乳狀液的微觀結構，證明大豆肽-葡聚糖共聚物可以在油滴表面形成一個很厚的吸附層，提高油滴的抗破乳能力，增加乳液的穩定性[8-10]。

2.2 一級結構

傅里葉紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectoscopy，FT-IR）能夠反應糖基化蛋白一級結構的變化，主要體現在C-N和N-H鍵吸收峰彎曲振動。FT-IR研究發現，大豆蛋白-果糖共聚物在1 600～1 500 cm-1處的酰胺I特征峰和在1 500～1 400 cm-1酰胺Ⅱ特征峰波動減弱[12]；大豆蛋白-葡聚糖共聚物在1 410 cm-1區域的酰胺Ⅲ特征峰振動增強，相應的，C-O伸展和O-H彎曲也發生了變化，即在2 931 cm-1和3 290 cm-1處發生了C-H伸縮振動與N-H的伸縮振動，證實美拉德反應對大豆蛋白一級結構產生影響[13]。

2.3 二級結構

糖基化導致食品蛋白質的二級結構發生改變，主要形式包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲數量的變化，這決定了蛋白質的構象和功能。二級結構可以通過圓二色譜（Circular Dichroism，CD）和FT-IR來檢測。利用CD分析證實，大豆蛋白-麥芽糖共聚物與大豆蛋白相比，α-螺旋、β-折疊和β-轉角含量降低，無規則卷曲含量顯著增加，美拉德反應對大豆蛋白的二級結構有顯著影響[11]。采用葡萄糖、乳糖與11S大豆球蛋白分別進行美拉德反應后，利用FT-IR檢測發現11S大豆球蛋白-葡萄糖共聚物和11S大豆球蛋白-乳糖共聚物的α-螺旋、β-折疊、β-轉角的含量都顯著減小，但無規則卷曲的含量顯著增加，證實美拉德反應對11S大豆球蛋白二級結構影響顯著[12]。

2.4 三級結構

一般來說，利用熒光光譜分析色氨酸光譜，能夠觀察蛋白質三級結構的變化情況。利用內源熒光光譜發現，大豆蛋白-果糖共聚物的熒光強度降低，最大激發波長（λmax）增加，證實美拉德反應改變了大豆蛋白的三級結構[13]。利用外源熒光光譜進行分析，大豆蛋白水解物-葡聚糖共聚物的最大熒光強度發生了紅移現象，色氨酸的周圍環境極性增強，且熒光強度降低，這一結果證實美拉德反應使葡聚糖取代大豆蛋白表面的分子，對大豆蛋白的三級結構產生顯著影響[14]。

3 美拉德糖基化產物功能性質的變化

3.1 溶解性

溶解性是指大豆蛋白在水溶液中的溶解能力。大豆蛋白的溶解性在食品加工中起到了重要作用，美拉德反應使大豆蛋白的親水性羥基增多，改善蛋白質的溶解性，從而擴大大豆蛋白的應用范圍。干熱法制備的大豆蛋白-葡萄糖共聚物的溶解性顯著高于大豆蛋白，而且也顯著高于超聲法改性大豆蛋白，表明美拉德反應比超聲法更有利于提高大豆蛋白的 溶解性[15]。

反應時間會影響大豆蛋白的溶解性。美拉德反應初期，大豆蛋白中引入大量親水性糖分子，親水性羥基含量增加，溶解性增高。然而，反應時間過長，會有一部分蛋白質因分子量增大發生聚集沉降，導致溶解度下降。同時，美拉德反應時間過長，會進入到晚期階段，生成類黑素等大分子物質，最終蛋白質的溶解性降低。在90 ℃水浴條件下，將大豆蛋白與乳糖按質量比4∶1進行美拉德反應實驗，加熱時間分別為1～5 h，制備得到大豆蛋白-乳糖共聚物。結果證實，隨反應時間增加，大豆蛋白的溶解性逐漸增強，當反應達到3 h后，隨著反應時間的增加，溶解性逐 漸下降[16]。

糖的種類也會影響大豆蛋白的溶解性。在80 ℃條件下，按1∶4的質量比分別將葡萄糖、麥芽糖與大豆蛋白相混合，制備糖基化產物，發現隨反應時間增加兩種糖基化大豆蛋白的溶解性逐漸升高，且高于大豆蛋白。此外，大豆蛋白-麥芽糖共聚物的溶解性總是高于大豆蛋白-葡萄糖共聚物。反應時間高于6 h后，兩種產物的溶解性下降，其中大豆蛋白-葡萄糖共聚物的溶解性要低于大豆蛋白。葡萄糖分子較小，與麥芽糖相比更容易與大豆蛋白發生反應，產生類黑素等，反應時間過長會降低大豆蛋白的溶解性[17]。

3.2 乳化性質

乳化性是大豆蛋白乳濁液形成能力與穩定性的重要影響因素，而大豆蛋白的乳化性是由其本身的結構與溶解性決定的。美拉德反應可以使大豆蛋白的親水性增強，更有利于有效吸附在油-水界面上，通過降低表面張力來提高蛋白質的乳化性及乳化穩定性。通過改變大豆蛋白與阿拉伯膠的原料質量比、反應時間制備出乳化性顯著提高的大豆蛋白。研究證實在質量比1∶2（阿拉伯膠∶大豆蛋白）、反應溫度60 ℃條件下反應16 h，大豆蛋白的乳化性顯著提高51.2 m2·g-1[14]。

美拉德反應時間增加會改變大豆蛋白的結構，對乳化性及乳化穩定性產生影響。美拉德反應初期，蛋白質的游離氨基逐漸暴露在蛋白質分子表面，隨反應時間增加生成更多的糖基化產物，親水性羥基增加，達到親水和親油的平衡，乳化性增強；美拉德反應時間過長，反應體系中游離氨基和殼寡糖的羰基逐漸減少，蛋白質發生自交聯，溶解性逐漸下降，乳化性降低。此外，糖基化產物增加，會使吸附在油-水界面處油滴上的保護層厚度有所增大，油滴不易發生聚集現象，乳化穩定性增強。以葡萄糖和大豆蛋白原料，在質量比4∶1、反應溫度70～90 ℃條件下反應0～6 h， 得到反應時間和溫度不同的大豆蛋白-葡萄糖共聚物。結果證實，隨反應時間增加，反應體系的顏色不斷加深，且乳化性及乳化穩定性顯著提高；在反應 6 h時，大豆蛋白乳化性提高最為顯著，從0.168提高到了0.574。在反應4 h時，乳化穩定性提高最為顯著，從17.37%提高到38.7%[18]。在不同反應時間、反應溫度條件下制備大豆蛋白-殼寡糖共聚物，以乳化性為響應面，探究制備高乳化性的大豆蛋白-殼寡糖共聚物的最佳反應條件。結果發現，大豆蛋白-殼寡糖共聚物的乳化性以及乳化穩定性隨反應時間的增加出現先升高再降低的趨勢，且在反應時間為9 h時達到最高值[19]。

美拉德反應溫度也會對乳化性及乳化穩定性產生影響。控制美拉德反應溫度可以使蛋白質結構得到伸展，提高蛋白質的分子表面活性，減少空間位阻，有利于蛋白質與糖分子發生反應，生成大量糖基化產物，提高大豆蛋白的乳化性及乳化穩定性。但是溫度過高時，蛋白質會發生變性，分子的表面活性降低，阻礙兩者的結合，從而減少糖基化產物產生，使乳化性及乳化穩定性下降。以大豆蛋白和殼寡糖為原料，采用不同溫度條件下反應9 h制備大豆蛋白-殼寡糖共聚物。結果證實，反應溫度對乳化性和乳化穩定性產生影響不同，在40 ℃時大豆蛋白-殼寡糖共聚物的乳化性以及乳化穩定性達到最大值[19]。

3.3 流變性

流變性測定包括蛋白質的表觀黏度以及黏彈性能。食品蛋白質的黏彈性不同，會賦予食品不同的質感。在超聲和未超聲條件下制備大豆蛋白-香菇多糖共聚物，證實大豆蛋白-香菇多糖共聚物在未超聲條件下，表觀黏度顯著提高（13.89%），超聲40 min后表觀黏度（26.48%）是傳統方式1.91倍。美拉德反應能夠提高大豆蛋白的表觀黏度，且與超聲法結合后大豆蛋白的表觀黏度改善更加明顯[20]。將大豆蛋白與葡萄糖按質量比1∶2混合，在95 ℃條件下反應4 h，得到大豆蛋白-葡萄糖共聚物，通過轉谷氨酰胺酶法制備凝膠，對凝膠模擬體外胃腸道消化實驗，證實消化產物的黏度、彈性模量（G′）、黏性模量（G″）顯著升高[21]。

4 大豆蛋白及其糖基化產物在食品加工中的應用

大豆蛋白因為其良好的營養品質及多種功能特性而被廣泛應用于肉制品、焙烤食品、飲料、乳品、食品涂層和糖果等食品工業領域。

4.1 在肉制品中的應用

大豆蛋白及其糖基化產物在肉制品中能夠改善肉制品的風味、阻止肉汁分離和提高肉類制品的品質等。在豬肉制品中加入大豆蛋白后，不僅能提高肉制品的硬度，增強了咀嚼口感，而且還能彌補肉制品高熱量、高膽固醇等缺點[22]。將大豆蛋白糖基化產物與肌原纖維蛋白混合制成凝膠，證實添加大豆蛋白的肌原纖維凝膠比原肌原纖維蛋白凝膠微觀結構更加致密均勻，且提升了肌原蛋白凝膠的彈性和硬度[23]。

4.2 在烘焙制品中的應用

大豆蛋白及其糖基化產物在烘焙制品中能夠改善食品的色澤，提升口感和風味，還可以保持游離水，有效延長產品的貨架期。通過美拉德反應制備大豆蛋白-低聚木糖共聚物，證實該共聚物添加在重油蛋糕中，能有效延長重油蛋糕的貨架期，提高重油蛋糕的適口性以及耐儲藏特性[24]。在面包的制作過程中加入糖基化大豆蛋白，面包的硬度降低，而且面包的彈性和回復性提高[25]。

4.3 在冰淇淋中的應用

冰淇淋是受到人們喜歡的一種乳制品，但是有一部分人患有乳糖不耐癥，將大豆蛋白添加在冰淇淋中可以降低其乳糖含量，使消費者有效避免乳糖不耐癥的不良反應。以大豆蛋白和乳粉為原料，按一定比例制作冰淇淋，發現添加大豆蛋白使冰淇淋的融化率、黏度與硬度顯著提高，且無不好的豆腥味，感官評價的綜合指標增加，適合應用于冰淇淋生產[26]。將大豆蛋白和乳清蛋白按比例進行配比制備出復配蛋白質，分析發現復配蛋白冰淇淋的硬度較好、抗融化性以及膨脹率增強[27]。

5 糖基化產物構效關系研究存在的局限性

研究證實美拉德反應的糖基化可以改善大豆蛋白的許多重要功能性質，在食品領域具有一定發展潛力。目前，基于美拉德途徑的蛋白質糖基化修飾，通常采用兩種方式調控蛋白質的糖基導入量：一種手段是控制糖基化反應時間，但該法存在一定的局限性，如存在反應過度產生類黑素等有害物質的情況，而且將破壞蛋白質的功能性質；另一種方式是通過改變導入糖基的分子量，如分別將單糖、寡糖、多糖導入到蛋白質中，獲得具有不同糖基導入量的蛋白質。值得注意的是，美拉德反應在導入糖基的同時，還伴隨著蛋白質的自交聯現象。因此，上述方法在剖析糖基導入量對美拉德產物功能性質的影響規律時，很難界定蛋白質自交聯帶來的潛在影響，所得結論缺乏嚴謹性、科學性。

6 展望

闡明美拉德反應中糖基變化對蛋白質構效關系的影響機制，對開發特定功能性食品配料具有重要意義。但是，目前美拉德糖基化研究在該方面具有一定局限性，急需在保證大豆蛋白自交聯程度不變的前提下，基于定向改變糖基化大豆蛋白側鏈糖基的方法，開展揭示美拉德途徑糖基化蛋白質構效關系的相關研究，通過各個指標的分析和評估研究，確定、剖析大豆蛋白糖基化產物結構和功能性質的影響模式和機制，為定向開發特定功能的大豆蛋白配料提供理論支撐，有利于擴大大豆蛋白在食品加工領域中的應用范圍。