健脾祛風湯對特應性皮炎患者腸道菌群的影響

羅瑞靜, 劉 杰, 彭 勇, 王英杰, 武宗琴, 姜珠倩, 李 淑

(上海市嘉定區中醫醫院 皮膚科, 上海, 201899)

特應性皮炎(AD)是一種機體免疫失衡導致的慢性炎癥性皮膚病[1], 中醫學稱其為“四彎風”。研究[2]證實，腸道菌群可以通過免疫、代謝和神經內分泌途徑參與AD的發病，而中藥則可以通過調節腸道菌群來治療AD[3]。本課題組前期研究[4]顯示，健脾祛風湯治療脾虛型AD總有效率為82.11%。本研究探討健脾祛風湯對AD患者腸道菌群的影響，以闡明其可能治療機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究共納入57例志愿者。將2015年4月—2017年4月在上海市嘉定區中醫醫院皮膚科門診就診的30例AD 患者納入治療組(治療前簡稱TB組，治療后簡稱TA組)，其中男18例，女12例; 平均年齡8.6歲。將27例健康兒童納入健康對照組(簡稱N組)，其中男17例，女10例，平均年齡8.0歲，均來自上海市嘉定區城中路小學和普通小學。2組入選者年齡、性別比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準，且研究對象及家長或監護人均知情同意。

治療組納入標準: ① 符合WILLIAMS HC[5]診斷AD 標準者; ② 6～12 歲兒童; ③參照歐洲AD特別工作組確定的SCORAD系統[6], 病情嚴重度分級屬輕、中度者; ④ 參照《中藥新藥臨床研究指導原則(2002年)》[7], 符合濕瘡脾虛證者(主癥: 皮膚瘙癢，皮損以丘疹或丘皰疹為主，皮膚色暗淡或有鱗屑，少許滲出；次癥: 食少乏力，腹脹便溏，小便清長或微黃); ⑤ 病程1年以上，每年緩解期≤3個月者; ⑥ 同意服用中藥并簽署知情同意書(監護人簽字)者。排除標準: ① 患有其他皮膚疾病者; ② 近2 個月內服過糖皮質激素或近2 周內外用過此類藥品者; ③ 近2個月內系統使用其他有效治療藥物者; ④ 在參加或入選前4周內，曾參加過其他藥物臨床試驗者; ⑤ 心、肝、腎等臟器嚴重異常者; ⑥ 精神疾病、殘疾、智力障礙者; ⑦ 近2周患腹瀉等腸道疾病或使用抗生素者; ⑧ 近2周服用含益生菌等微生物制劑者; ⑨ 對已知試驗藥物過敏者; ⑩ 有可能無法完成本研究全過程者。健康對照組納入標準: 6～12歲健康兒童。排除標準: ① 近2周患腹瀉等腸道疾病或使用抗生素者; ② 近2周服用含益生菌等微生物制劑者。

1.2 方法

1.2.1 治療方法: 治療組口服健脾祛風湯(炒白術15 g、白茯苓10 g、荷葉10 g、炒白芍10 g、升麻6 g、炒枳殼6 g、荊芥10 g、防風10 g、徐長卿12 g、白鮮皮15 g、黃芩12 g、苦參10 g、地黃10 g、甘草6 g), 水煎內服，1劑/d, 100 mL/次, 2次/d, 由本院中藥煎藥室制備; 同時外涂尿素乳膏(浙江康恩貝制藥股份有限公司，國藥準字H33022524), 使用時先用溫水清洗患處，輕輕擦干后，將藥物均勻涂于患處, 2次/d; 皮損滲出較重者，予生理鹽水濕敷患處。共計觀察6周。

1.2.2 樣本采集: 治療組在治療前后采集糞便，健康對照組僅在納入研究時采集糞便。將糞便放在糞便收集盒中，要求避免尿液、灰塵等污染，選取中段無污染的部分，糞便標本量>1 g。標本采集后標記姓名，并進行編號，標記后存儲于-20 ℃冰箱，干冰運送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行檢測。

1.2.3 主要儀器及試劑: IlluminaMiseq型MISEQ測序儀購自美國Illumina公司; DNA抽提試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司; TruSeqTM DNA SamplePrepKit型Illumina MiSeq platform購自美國Illumina公司。

1.2.4 DNA提取及聚合酶鏈反應(PCR)擴增: 根據E.Z.N.A.?soil試劑盒說明書進行總DNA抽提, DNA 濃度和純度利用NanoDrop 2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量; 用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對16S rDNA V3～V4可變區進行PCR擴增。

1.2.5 Illumina MiSeq測序及分析: 應用上海美吉生物醫藥科技有限公司Illumina MiSeq測序平臺對研究對象糞便細菌的16SrRNA 基因V3～V4區進行高通量測序及分析。

1.3 觀察指標

主要療效評價指標: 采用歐洲特應性皮炎研究組(ETFAD)提出的評分標準(SCORAD評分)進行評估。

臨床療效評價標準: 參照《中藥新藥臨床研究指導原則》中的療效標準進行評定。有效率=(治療前SCORAD分值-治療后SCORAD分值)/治療前SCORAD分值×100%。痊愈: 皮損全部消退，瘙癢癥狀消失，有效率≥90%; 顯效: 皮損大部分消退，瘙癢明顯減輕，有效率為60%～<90%; 進步: 皮損部分消退，瘙癢癥狀有所改善，有效率為20%～<60%; 無效: 皮損消退不明顯，瘙癢未見減輕，或臨床癥狀惡化，有效率<20%。總有效率=(痊愈+顯效+進步)/總例數×100%。

1.4 統計學分析

應用SPSS 22.0軟件進行統計分析，以P=0.05為檢驗標準。計量資料采用t檢驗，若不符合正態分布，采用秩和檢驗。借助I-Sanger生物信息云平臺(http: //www.i-sanger.com), 應用R的stats包和python的scipy包進行分析。選擇2組豐度排名前15的門、屬、種分別比較物種差異，采用Wilcoxon秩和檢驗,P<0.05為差異有統計學意義; 通過計算物種之間的斯皮爾曼等級相關系數，構建物種相關性網絡，借助Networkx網絡分析工具包進行單因素相關性網絡分析。

2 結 果

2.1 中藥干預臨床療效及SCORAD評分結果

治療組共納入30例符合標準的患者，其中痊愈0例、顯效18例、進步11例、無效1例，總有效率為96.67%。治療后SCORAD評分(18.02±1.63)分，低于治療前的(42.23±1.42)分，差異有統計學意義(P<0.001)。

2.2 樣本信息統計

治療組共采集60個糞便樣本，其中8個樣本經檢測不合格予以剔除，最終保留52個合格樣本; 健康對照組共采集27個合格樣本; 2組總計采集79個合格糞便樣本。對樣本物種注釋分類后, 79個樣本共獲得1個域, 20個門, 36個綱, 60個目, 98個科, 262個屬, 472個種, 643個可操作分類單元(OTU)。

2.3 物種組成分析

通過在門、屬水平物種組成分析發現: TB組、TA組與N組腸道菌群組成主要為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)共5門，各組間相同門、屬水平物種豐度比較存在一定差異，主要表現為TA組較TB組厚壁菌門、屬水平物種豐度升高，以及擬桿菌門、屬水平物種豐度降低，提示健脾祛風湯治療后腸道菌群豐度發生變化，見圖1。

A: 3組門水平物種組成圖; B: 3組屬水平物種組成圖。

2.4 治療前后門、屬、種水平重要物種豐度比較

2.4.1 治療前后門水平物種豐度比較: 治療后厚壁菌門(Firmicutes)呈升高趨勢，擬桿菌門(Bacteroidetes)呈降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05); 與TB組比較，綠屈撓菌門(Chloroflexi)治療后豐度增加，差異有統計學意義(P<0.05), 見表1、圖2。

2.4.2 治療前后屬水平物種豐度比較: 治療后厚壁菌門下Faecalibacterium、[Eubacterium]_rectale_group、Blautia呈升高趨勢。與TB組比較,Blautia豐度升高，差異有統計學意義(P<0.05); 擬桿菌門下Bacteroides呈降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05), 見表2、圖3。

表1 治療前后門水平物種豐度比較 %

2.4.3 治療前后種水平物種豐度比較: 厚壁菌門下unclassified_g_Faecalibacterium、unclassified_g_[Eubacterium]_rectale_group、Ruminococcus_sp._5_1_39BFAA呈升高趨勢。排名靠后物種Dialister_invisus_DSM_15470呈降低趨勢，差異有統計學意義(P<0.01); 擬桿菌門下Bacteroides_vulgatus_ATCC_8482、Bacteroides_xylanisolvens_g_Bacteroides、Bacteroides_uniformis呈降低趨勢，但差異均無統計學意義(P>0.05)。此外，致病菌unclassified_g_Klebsiella治療后豐度降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4、表3。

2.5 物種網絡結構屬性圖及單因素相關性網絡分析結果

通過屬、種水平網絡結構屬性圖可以看出: AD患者腸道菌群不同屬、種之間具有顯著相互作用(綠色連線表示正相關，紅色連線表示負相關，連線的粗細代表相關性系數的大小)，見圖5A、圖6A。

表2 治療前后屬水平物種豐度比較 %

表3 治療前后種水平物種豐度比較 %

物種相關性Heatmap圖分析結果顯示: 在屬水平，重要物種厚壁菌門下Blautia與擬桿菌門下Bacteroides呈負相關(R=-0.41,P<0.01), 見圖5B。在種水平，重要物種擬桿菌門下Bacteroides_vulgatus_ATCC_8482與Bacteroides_xylanisolvens_g_Bacteroides呈正相關(R=0.70,P<0.001); 擬桿菌門下Bacteroides_uniformis與Bacteroides_vulgatus_ATCC_8482呈正相關(R=0.61,P<0.001), 與厚壁菌門下Ruminococcus_sp._5_1_39BFAA(R=-0.43,P<0.001)、unclassified_g_Fusicatenibacter(R=-0.44,P<0.001)呈負相關，見圖6B。提示菌群之間存在復雜的正、負相關作用，其中厚壁菌門與擬桿菌門下屬菌群存在顯著負相關。

A: 屬水平物種網絡結構屬性圖; B: 屬水平單因素相關性網絡分析。分類水平為屬，顏色顯示水平為門。圖中節點的大小表示物種豐度大小，不同顏色表示不同的物種; 連線的顏色表示正負相關性，紅色表示正相關，綠色表示負相關;線的粗細表示相關性系數的大小，線越粗，表示物種之間的相關性越高; 線越多，表示該物種與其他物種之間的聯系越密切。X軸和Y軸均為物種，通過計算獲得相關系數R值和P值, R值在圖中以不同顏色展示。

3 討 論

AD 作為一種世界范圍內常見的炎癥性皮膚病，可發生于任何年齡，近年來，兒童AD的患病率呈上升趨勢[8]。目前，關于AD的發病機制仍未完全闡明, Th1、Th2、Th17、Treg等細胞因子在AD的發生發展中為異質性且動態變化[9-10]。研究[11]證實，皮膚及腸道微生物可以通過多條途徑參與AD的發病，而中藥則可以通過調節腸道菌群治療AD[3]。

人體內95%的微生物群存在于腸道，且主要集中在結腸，這些腸道微生物可以通過多條途徑影響機體功能，當其發生變化時，可以導致疾病的發生[11]。研究[12]證實，人在5歲以后，其腸道微生物組的組成趨于相對穩定狀態，故本研究選取6～12歲人群為研究對象; 此外，應用Illumina Miseq測序平臺對研究對象糞便細菌的16SrRNA基因V3～V4區進行高通量測序檢測腸道菌群[13]。雙歧桿菌、鏈球菌、乳球菌和乳酸桿菌被認為是人類幼年時最豐富的細菌種類之一，而擬桿菌和厚壁菌則在成年期更為豐富[14]。本研究發現, TB組、TA組與N組腸道菌群組成中占優勢的菌有厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門，與相關研究[15]結果相一致，提示整個實驗過程中腸道菌群檢測結果相對穩定，具有可比性。

A: 種水平物種網絡結構屬性圖; B: 種水平單因素相關性網絡分析 。分類水平為種，顏色顯示水平為屬。圖中節點的大小表示物種豐度大小，不同顏色表示不同的物種; 連線的顏色表示正負相關性，紅色表示正相關，綠色表示負相關;線的粗細表示相關性系數的大小，線越粗，表示物種之間的相關性越高; 線越多，表示該物種與其他物種之間的聯系越密切。X軸和Y軸均為物種，通過計算獲得相關系數R值和P值, R值在圖中以不同顏色展示。

腸道微生物群組成及其與宿主關系的失衡可能與過敏性疾病的發生有關。微生物群組成與特應性癥狀和(或)過敏之間存在關聯，但無法確定哪些微生物與過敏性疾病的發生相關[16]。MELLI L C等[17]發現過敏性疾病腸道菌群表現為擬桿菌屬(Bacteroides)豐度增加。PETERSEN E B M等[18]對PubMed中相關文章分析發現，所有研究主要集中在探討AD患者腸道菌群中雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、擬桿菌和乳酸桿菌等的變化情況，但報道結果不一，且具體作用機制仍未闡明。2018年本課題組在AD患者與健康人群腸道菌群差異研究中發現AD患者與健康人腸道菌群存在差異，推測擬桿菌可能在AD的發病中發揮重要作用[19]。此外，本課題組前期在進行AD患兒與正常兒童腸道菌群Network 網絡分析研究中還發現，擬桿菌門與厚壁菌門存在負相關作用[20]。近來, YE S Q等[21]研究發現, AD患者腸道菌群中Porphyromonadaceae、Blautia、Parabacteroides、Bacteroidesovatus、Bacteroidesuniformis、Prevotellastercorea豐度增高,ClostridiumandP.stercorea豐度降低; 推測Bacteroidaceae、Porphyromonadaceae可以區分AD患者與健康人。基于本課題組前期研究成果，結合已有研究報道，提示腸道菌群中擬桿菌及厚壁菌物種豐度變化參與AD的發病。本研究顯示，治療后擬桿菌及厚壁菌物種豐度在門、屬、種不同水平發生變化，主要表現為擬桿菌門及其下屬、種水平豐度呈現降低趨勢，而厚壁菌門及其下屬、種水平豐度呈現升高趨勢；物種相關性分析顯示，擬桿菌門及厚壁菌門相關屬、種物種存在負相關，同時network網絡研究顯示擬桿菌門下Bacteroides_uniformis與Bacteroides_vulgatus_ATCC_8482發揮重要作用，提示擬桿菌門物種豐度降低具有重要意義。此外，有研究[22]認為Faecalibacteriumprausnitzii降低是AD診斷標記物。本研究中,Faecalibacterium[TB: (13.20±8.19), TA: (16.71±11.48)]及其下種unclassified_g_Faecalibacterium[TB: (13.2±8.19), TA: (16.71±11.48)]治療后豐度增加明顯，進一步驗證了這一研究結果。

綜上所述，健脾祛風湯的治療作用可能與厚壁菌門及擬桿菌門物種豐度的變化相關。但本研究存在樣本量相對不足，健康對照組的設定方法不夠嚴謹等問題，今后將進一步完善，并深入開展以代謝組學為主的機制研究。