止痛消結散對小鼠腫瘤細胞與DRG神經元共培養模型TRPV1表達的影響

郭玉玉，胡佳佳，郁沙莎，翟笑楓

（中國人民解放軍海軍軍醫大學第一附屬醫院中醫腫瘤科，上海 200083）

癌痛（癌性疼痛）特指由腫瘤直接浸潤神經根、神經干、神經叢或者神經，累及空腔及實質器官，誘發局部壞死、炎癥等，引起疼痛，常伴有牽涉痛，對惡性腫瘤患者的生活和生存質量產生了嚴重的影響，為目前發生率最高和最難耐受的臨床癥狀之一，同時也是治療惡性腫瘤的重要組成部分。目前，世界衛生組織已經將癌痛全面納入癌癥綜合規劃治療內容之中[1]。

背根神經節（DRG）神經元是靠近椎間孔內側的脊髓背根腫脹結節，接收來自身體受體的所有神經沖動，包括疼痛。目前的研究[2]表明，與疼痛傳遞密切相關的膜通道辣椒素受體1，也稱為TRPV1受體（TRPV1），是一種對Ca+具有高度親和力的非選擇性陽離子通道，它在多感覺傷害感受器中表達，并介導多種急性和持續性疼痛，如外周和中樞神經系統炎性疼痛和癌癥疼痛，在調節疼痛方面發揮重要作用。有文獻[3]證明，Lewis肺癌細胞晚期骨轉移后，感覺神經纖維上TRPV1受體被局部酸性腫瘤微環境激活，進而誘導骨骼感覺神經產生，導致骨痛的發生。基于此，本研究通過實驗建立腫瘤細胞與DRG神經元共培養模型以及藥物干預模型，探討止痛消結散的止痛作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

小鼠背根神經節神經元細胞、A549細胞，購自無錫菩禾生物醫藥技術有限公司。

1.2 藥物及主要試劑

止痛消結散，上海雷允上藥業有限公司。Trizol（invitrogen）；DEPC處理水（購自Sigma）；氯仿/異丙醇/無水乙醇（購自上海國藥）；SYBRGreen PCR試劑盒（型號Thermo F-415XL）；逆轉錄試劑盒（型號Thermo K1622）。

1.3 主要儀器

低溫冷凍離心機（型號Sigma 3K15）；Realtime檢測儀（型號ABI-7500）；光學顯微鏡（型號XDS-1A）；電泳儀（購自BIO-RAD 公司，型號mini protean 3 cell）；電轉儀（PS-9，大連競邁科技有限公司）；酶標儀（型號ThermoMK3）；一體式化學發光成像儀（型號ChemiScope 5300 Pro）。

1.4 止痛消結散浸提液制備

稱取1 g止痛消結散粉末于50 mL離心管，加入15 mL DF12基礎培養基，置于水浴鍋37 ℃溶解5 h，取上清，用過濾器過濾待用。

1.5 腫瘤細胞與DRG神經元細胞共培養模型建立及分組

1）制備神經元細胞懸液：消化收集神經元細胞，調整神經元細胞濃度至106/mL，6孔板中接種106/孔；2）腫瘤細胞共培養：制備A549細胞懸液，調整細胞濃度為106/mL，在神經元細胞培養孔中加入0.4 μm的transwell小室，上室接種腫瘤細胞2×105/孔；3）止痛消結散處理：共培養模型更換新鮮含1/10止痛消結散浸提液的完全培養基，下室2 mL，上室500 μL，培養24 h或48 h后收集細胞或上清液進行各指標檢測。實驗分組：1）A組，DRG神經元；2）B組，腫瘤細胞+DRG神經元組（24 h）（DRG下室，腫瘤細胞上室）；3）C組，腫瘤細胞+DRG神經元組（48 h）；4）D組，腫瘤細胞+DRG神經元組+止痛消結散（24 h）；5）E組，腫瘤細胞+DRG神經元組+止痛消結散（48 h）。

1.6 酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測上清液中IL-6的表達情況

共培養模型更換新鮮含1/10止痛消結散浸提液的完全培養基，下室2 mL，上室500 μL，培養24 h或48 h后收集48孔板各組上清液至無菌離心管中，標記組，取出6孔板中的原培養基，用PBS清洗1次；加入1 mL胰蛋白酶消化至大部分細胞變圓，加入完整培養基終止消化，以1 200 rpm離心3 min收集細胞；用PBS清洗2次。檢測收集的細胞上清液中IL-6的含量，檢測步驟按照試劑盒說明書進行。

1.7 Western Blot法檢測共培養體系相關蛋白表達情況

加入PMSF的預冷Ripa裂解液至樣品中，充分裂解12 000 g，離心10 min，取上清液，定量蛋白質并將其儲存在-80℃冰箱中。蛋白質樣品電泳和膜轉移；BSA在室溫下封閉1 h或4℃過夜。一抗在4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min。二級抗體與膜在37 ℃孵育1 h，用TBST洗滌3次，每次5 min。在膠片上加入適量的ECL發光溶液，用集成化學發光儀拍照。

1.8 實時定量法檢測共培養體系相關基因的表達情況

收集細胞，用3 mL PBS洗滌細胞2次，棄上清液；加入1 mL Trizol試劑，給予充分均質，室溫下靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，劇烈搖動15 s，靜置3 min；4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清液；加入0.5 mL異丙醇，充分混合，在冰上放置20～30 min；4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液；添加1 mL 75%乙醇并清洗沉淀物。在4℃下離心7 500 g，持續5 min，并棄上清液；在超凈臺中吹干約5 min，并添加適量的無核糖核酸酶H2O溶解。提取的RNA反轉錄成cDNA，并用RT-PCR檢測。

1.9 統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。測量數據以平均值±標準差（±s ）表示。單因素方差分析用于多組之間的比較。2組間采用最小顯著性差異法（LSD法）進行比較。以P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 止痛消結散浸提液對IL-6表達的影響

見表1。

表1 止痛消結散浸提液對IL-6含量的影響（±s，n = 6）

表1 止痛消結散浸提液對IL-6含量的影響（±s，n = 6）

注：與A組比較，## P＜0.01；與B組比較，△△P＜0.01；與C組比較，▲▲P＜0.01；與D組比較，□□P＜0.01

組別 含量 /（pg·mL-1）A組 0.000±0.000 B組126.671±9.521##C 組157.899±7.486##△△D 組 65.454±2.900##△△▲▲E 組 32.336±1.825##△△▲▲□□

2.2 止痛消結散浸提液對TRPV1蛋白表達的影響

與A組相比，與腫瘤細胞共培養24 h和48 h后，目的蛋白TRPV1的表達水平顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；而在共培養體系中（24 h和48 h）分別加入止痛消結散處理后，目的蛋白TRPV1表達水平相比共培養組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。結果表明，止痛消結散浸提液能降低DRG神經元細胞中TRPV1蛋白表達水平。見圖1。

圖1 止痛消結散浸提液對DRG神經元細胞中TRPV1蛋白表達水平的影響

2.3 止痛消結散浸提液對I L-6 R、Trpv1mRNA表達的影響

Trpv1和IL-6R的變化情況類似，即相比A組，腫瘤細胞與DRG神經元共培養組（24 h，48 h），兩者表達水平顯著增加，其中共培養48 h比24 h顯著，差異有統計學意義（P＜0.01）；加入止痛消結散處理后，兩者表達水平顯著降低，其中共培養48 h下降程度比共培養24 h顯著，差異具有統計學意義（P＜0.01）。結果表明，止痛消結散浸提液能降低DRG神經元細胞中IL-6R、Trpv1 mRNA表達水平。結果見圖2。

圖2 止痛消結散浸提液對DRG神經元細胞中IL-6R、TRPV1 mRNA表達水平的影響

3 討論

目前，WHO提出的“癌痛三階梯”規范治療方案在臨床上應用較廣泛，絕大部分患者可有效緩解，但止痛藥使用后不良反應較多，易增加成癮性，反復使用易造成中樞神經系統發生適應性變化，對患者的身心健康和社會功能產生了巨大影響[4]。

祖國醫學通過應用辨證論治的理論，對癌痛病人進行辨證施治，提高了止痛藥的效果，并且安全性高，毒副作用較少，不存在成癮性和耐藥性，配合“癌痛三階梯”治療方案可以有效的增效減毒和增強止痛效果[5-6]。其中，中醫外治法聯合其他止痛治療方式治療癌痛療效確切、作用迅速、毒副作用小，治療過程安全，有效的提高了癌痛患者的生活質量、延長了患者的生存周期。

現代醫學普遍認為，癌痛的病理產生機制可能與中樞敏化、外周敏化、腫瘤對外周神經的直接作用和骨溶解等因素有關。腫瘤細胞與腫瘤組織周圍存在著大量的不同類型的炎性細胞，例如：中性粒細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、內皮細胞和T淋巴細胞，這些炎性細胞可以分泌不同類型的炎性介質，包括表皮生長因子、內皮素-1、轉化生長因子-α、緩激肽、白介素-1、白介素-6、腫瘤壞死因子-α、前列腺素等，這些不同類型的炎性介質通過其各自的受體直接或間接作用于初級傳入神經元，從而產生疼痛[7]。

在對止痛消結散中藥物的作用進行文獻分析后，發現方中的血竭具有抗炎、鎮痛的作用，其主要構成物質中的劍葉龍血素A和劍葉龍血素B等可以有效降低TRPV1的活性[8]。復方血竭可抑制UC大鼠白細胞介素-1β、白細胞介素-6的表達，上調白細胞介素-4和白細胞介素-10的表達，并且可以調節免疫功能異常，從而促進消除炎癥和修復組織[9]。乳香的主要成分乳香酸通過抑制白三烯的合成以及減少5-脂氧合酶的活性從而進一步發揮抗炎作用[10]。沒藥的主要成分為沒藥油，它能減少IL-6的合成，有效的預防牙周炎和齦炎相關性炎癥，其機理是能減少成纖維細胞釋放的致炎因子，故常常用于牙齦炎和牙周炎的治療[11]。IL-6是已知參與幾種炎癥和神經性痛覺過敏的促炎細胞因子[12-14]。在骨癌痛的大鼠模型中，脊髓中IL-6mRNA水平增加[15]。IL-6通過IL-6R的典型信號傳導或通過IL-6R的反式信號傳導對靶細胞發揮調控作用[16]。

本研究觀察到，在腫瘤細胞與DRG神經元細胞共培養模型中加入止痛消結散浸提液后， IL-6表達水平明顯降低，時間越長，IL-6表達下降越明顯，表明止痛消結散浸提液能夠抑制IL-6的表達。同時，在共培養體系中加入止痛消結散浸提液處理后，目的蛋白TRPV1表達水平顯著降低，表明止痛消結散浸提液能降低DRG神經元細胞中TRPV1蛋白表達水平。因此，止痛消結散能有效的緩解腫瘤患者的癌性疼痛，其作用機制可能與下調DRG神經元中TRPV1表達水平有關。