自體富血小板凝膠聯合脂肪干細胞對糖尿病足大鼠lncRNA的影響*

馮召嵐 盛健健 董愛武 李江雄 曹玲玲

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）為因絕對或相對缺乏胰島素誘導的慢性內分泌與代謝疾病，以2型糖尿病多見，最新調查發現，中國2 型糖尿病發病率已經達到11.3%，有較高致死率與致殘率[1]。DM 患者常伴發踝以下組織感染、深層組織破壞或潰瘍，即糖尿病足（diabetic foot，DF）[2]，目前治療DF 主要以控制血糖、抗感染、潰瘍清創、促進組織再生等為主[3]。自體富血小板凝膠（autologous platelet-rich gel，APG）最早用于骨科、燒傷整形科、頜面外科等，治療效果好，而脂肪干細胞（ADSCs）治療DF 主要依據干細胞可于體內分化成平滑肌細胞及血管內皮細胞，分泌大量的血管內皮生長因子（VEGF），可促進下肢的血流盡快恢復，以治療該病[4]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）作為一種競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），通過吸附miRNA 參與調控靶基因表達從而影響細胞的功能已被證實，雖然lncRNA 因缺少完整開放的閱讀框而不具有編碼蛋白質的能力，但其可有效地調節脂肪細胞分化、糖脂代謝[5]。本研究通過構建DF 大鼠模型，研究APG 聯合ADSCs 治療DF 的效果，并對潰瘍組織進行lncRNA 芯片分析，探討APG 聯合ADSCs 對lncRNA 表達的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 于2021 年6-9 月選取30 只SPF 級別的C57BL/6 大鼠（江蘇艾菱菲生物科技）。體重195～215 g，平均（205.64±5.49）g，放置于潔凈實驗動物房飼養，自然光線，自由飲食，溫度21～27 ℃，濕度42%～61%。肝素（常州千紅生化制藥股份有限公司）、氯化鈉注射液（生產廠家：杭州民生藥業股份有限公司，批準文號：國藥準字H20043304，規格：1 000 mL∶9 g）、利多卡因（生產廠家：上海朝暉藥業，批準文號：國藥準字H31021071，規格：20 mL∶0.4 g）、腎上腺素（生產廠家：無錫濟民可信山禾藥業股份有限公司，批準文號：國藥準字H32024032，規格：1 mL∶1 mg）。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠DF 模型 在適應性地喂養1 周后隨機分為正常組、對照組、治療組，各10 只。正常組自由飲水不建模，其余兩組建立DF 模型。模型建立方法：經鏈脲霉素（STZ）（生產廠家：Sigma-Aldrich 公司，貨號：S0130）誘導建立模型[6]。予以高糖高脂飼料，包括豬油、蔗糖、膽固醇、豬膽酸鹽、雞蛋、黃豆芽及基本飼料，分別占11.0%、19.0%、2.5%、1.0%、1.0%、29.0%、36.5%，在4 周后腹腔注射1 次30 mg/kg STZ，注射3 d 后采集大鼠尾靜脈血，測得的隨機血糖在16.7 mmol/L 以上則認為成功造模T2DM。在造模后3周，對大鼠進行麻醉，足背部消毒，后進行DF 造模，采用矩形印章在大鼠足背面剪下矩形（2 mm×5 mm）傷口，銳性移除全層皮膚，制造DF 模型，DF 造模成功標準：肢端出現不同程度紫黯、紅腫、潰瘍與壞疽。制造全層皮膚創面后第2 天觀察并記錄24 h 內創面面積大小，測量時重復2 次。

1.2.2 APG 的制備 參考文獻[7]，經7%（0.3 mL/100 g）水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取5 mL 注射器，吸取0.3 mL 4%的枸櫞酸鈉抗凝劑，注射器連接硬膜外管，在大鼠頸靜脈取3 mL 的靜脈血，以1 100g離心10 min，后加0.3 mL 氯化鈣50 mg/mL以激活，靜置后中間淡黃色凝膠即為APG 凝膠，留取備用。

1.2.3 ADSCs 的制備 參考文獻[8]，采用250 mL氯化鈉注射液+2%利多卡因10～15 mL+腎上腺素0.25 mg 的腫脹液對脂肪組織區域進行局麻，以20 mL注射器配備口徑1.5～3.5 mm、側孔3.0～5.0 mm 的吸脂針，進入供區，形成負壓后呈扇形手動而均勻地吸取脂肪組織，吸出3～5 mm3脂肪組織顆粒，若脂肪組織顆粒較大，則需予以手工剪制。

1.2.4 分組處理及觀察 治療組于潰瘍處注射APG+ADSCs（用量均依據創面大小確定，0.1 mL/cm2），對照組注射等量磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）于DF 動物潰瘍處，正常組同樣在動物足部相同位置注射等量PBS。（1）三組均連續注射14 d，采集治療前（建模大鼠于建模成功時采集，對照組與正常組于同時間采集）、治療后尾靜脈血，經血糖儀測定大鼠血糖水平；（2）注射14 d 后將潰瘍組織固定在4%多聚甲醛溶液中。在治療前及治療后采用免疫印跡法測定炎癥因子[白介素-6（IL-6）、C 反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）]、VEGF、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）水平，以β-actin 為內標。

1.2.5 lncRNA 芯片分析 在治療后收集對照組、治療組的潰瘍組織，以及正常組對應位置組織，進行lncRNA 芯片分析，測定lncRNA 表達譜變化，探針為60 met 長寡核苷酸。先提取總RNA，cDNA 逆轉錄，熒光標記，排列雜交、清洗。后予以熒光強度掃描，掃描圖像傳至NumbleScan 軟件，以Agilent Gene Spring 軟件進行差異基因、功能富集研究。

1.3 統計學處理 采用SPSS 23.0 軟件對數據進行統計學處理，計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗、獨立樣本和配對樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組血糖水平檢測結果比較 治療14 d后，正常組血糖與治療前比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；對照組血糖水平顯著高于治療前，治療組血糖水平明顯低于治療前，且治療組低于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 三組血糖水平檢測結果比較[mmol/L，（）]

表1 三組血糖水平檢測結果比較[mmol/L，（）]

*與對照組比較，P＜0.05。

2.2 兩組炎癥因子及血管生成因子水平比較 治療前，兩組的IL-6、CRP、TNF-α 水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；治療14 d后，對照組的IL-6、CRP、TNF-α 水平均高于治療前，治療組上述指標水平均低于治療前，且治療組均低于對照組（P＜0.05）；治療14 d后，對照組的VEGF、bFGF 水平均低于治療前，治療組上述指標水平均高于治療前，且治療組均高于對照組（P＜0.05）。見表2、3。

表2 兩組炎癥因子水平比較（）

表2 兩組炎癥因子水平比較（）

*與治療前比較，P＜0.05。

表3 兩組血管生成因子水平比較[ng/100 μg，（）]

表3 兩組血管生成因子水平比較[ng/100 μg，（）]

*與治療前比較，P＜0.05。

2.3 各組lncRNA 表達譜分析 對照組與正常組比較存在1 627 個顯著差異的lncRNA，治療組與正常組比較存在1 896 個顯著差異的lncRNA，對照組與治療組比較存在2 576 個顯著差異的lncRNA。

2.4 lncRNA 表達差異譜的靶基因預測 將靶基因代入差異mRNA 數據，篩選得到DF 相關的靶基因有8個，分別為DLX6-AS1、CHI3L1、CAMTA1、STRADB、ARAP1-AS1、ARAP1-AS2、PVT1、ROR，其中DLX6-AS1、CHI3L1、STRADB、ARAP1-AS2、PVT1、ROR 高表達，CAMTA1、ARAP1-AS1 低表達。

3 討論

慢性并發癥DF 為DM 患者慢性皮膚潰瘍的主要原因，DF 所致的截肢占我國住院截肢者的28.2%。APG 為目前治療DF 的新方法，當APG 形成后，血小板被快速地激活，在5～10 d 后釋放出多種生長因子，其含有的豐富纖維蛋白及營造的相對潮濕低氧環境均有利于創面修復，預防感染[9]，而ADSCs 有多向分化潛能，在增殖速度、生長動力學和衰老凋亡方面與胚胎干細胞無差異，既往李雪陽等[10]發現，ADSCs+APG 可促進大鼠創面修復，其機制可能和調控TGFβ1-Smad、基質金屬蛋白酶表達存在關系，但目前關于APG 聯合ADSCs 是否可改善DF 血管新生及血供目前尚未見報道。

本次實驗發現，治療14 d后，對照組血糖水平顯著高于治療前，治療組血糖水平明顯低于治療前，且治療組的血糖低于對照組（P＜0.05），表明APG聯合ADSCs 對DF 大鼠血糖有較好調節作用。APG屬于自體富血小板血漿與促凝劑按照一定比例混合后形成的有生物修復能力的物質，屬于新型潰瘍治療方式，其含有豐富血小板，且具備高濃度的纖維蛋白、白細胞，其中白細胞能殺滅體內局部病原體，提高患者抗感染力，而纖維蛋白有組織構建作用，為避免白細胞與血小板流失，可將其進行嚴密包裹，為細胞修復供應支架，干細胞可經促進膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ及細胞角質蛋白19（CK19）表達而促進外皮形成，繼而改善潰瘍，改善DF 的血糖水平[11]。

CRP、IL-6、TNF-α 在DF 發病中起著重要作用，其中CRP、IL-6 可加快體內淋巴細胞分化，大量產生免疫球蛋白G，加速殺傷性T 淋巴細胞激活，可使體內胰島β 細胞發生凋亡，TNF-α 是單核巨噬細胞生成且具備多種生物學功能的多肽類細胞因子，可損傷血管內皮功能，加速DF 發展[12]。VEGF 表達能有效地促進血管通透性及表皮細胞增殖，加速新生血管生成，bFGF 表達則對機體修補增生肌膚表層細胞有直接的影響，能促進細胞增殖分化，替代衰老細胞。本次研究發現，治療后治療組IL-6、CRP、TNF-α 均低于對照組，而VEGF、bFGF 均高于對照組（P＜0.05）。APG 可促進機體組織恢復，此外APG 制備方法簡單，治療成本較低[13-14]。ADSCs 取材容易、對機體損傷性較小、體內的儲備量高[15]。故ADSCs 聯合APG 對降低DF 大鼠炎癥因子水平，促進新生血管形成具有積極影響。

本次研究發現，與正常組比較，對照組存在1 627 個顯著差異的lncRNA，治療組存在1 896 個顯著差異的lncRNA，對照組與治療組比較存在2 576 個顯著差異的lncRNA，將靶基因帶入差異mRNA 數據，篩選得到DF 相關的靶基因有8個，分別為DLX6-AS1、CHI3L1、CAMTA1、STRADB、ARAP1-AS1、ARAP1-AS2、PVT1、ROR，表明APG聯合ADSCs 可能通過改變lncRNA 的表達，而對DF 發揮降糖及治療作用。DLX6-AS1 參與細胞分化及形態學發展，屬于轉錄因子家族，在DF 中也發揮重要作用，既往李杰玉[16]發現，DF 患者血清中lncRNA DLX6-AS1 表達量升高，可能參與DF 發生及發展過程，并可能作為臨床診斷的分子標記物。CHI3L1 為一種分泌型糖蛋白，主要由軟骨細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞等細胞分泌，且參與細胞外基質重構、急慢性反應的病理過程，也可能對胰島素信號通路有阻斷作用從而誘導胰島素的分泌水平發生缺陷障礙[17]。CAMTA1 的活化對體內糖脂代謝有重要調節作用，STRADB 則能較好地維持胰島素分泌平衡，既往李曉燕等[18]也發現，APG 與臍帶干細胞聯用后經靶基因篩選得到CHI3L1、CAMTA1、STRADB 差異表達。ARAP1可通過調控Rho 激酶及表皮生長受體參與糖尿病腎病的發生，而lncRNA-ARAP1-AS1、lncRNAARAP1-AS2 均為位于11 號染色體上的lncRNA[19]。研究顯示表達下調的lncRNA-ARAP1-AS1 及表達上調的lncRNA-ARAP1-AS2 作用于靶基因mRNAARAP1，使mRNA-ARAP1 在糖尿病與糖尿病腎病中表達上調，可能通過調控Rho 激酶與EGF 受體途徑，參與糖尿病與糖尿病腎病的發生[20]。lncRNA PVT1 于多種腎細胞中均有表達，可能有助于糖尿病腎病腎小球特征性細胞外基質積累的增加，葉鳳等[21]發現，敲低lncRNA PVT1 可上調Nephrin和WT-1 的表達，下調Desmin 的表達，減少足細胞的凋亡，敲低PVT1 表達則可改善高糖刺激足細胞損傷與凋亡。lncRNA ROR 位于人18 號染色體，為一種非編碼RNA，可能參與面部皮膚的老化演變，其機制為lncRNA ROR 通過正向調控UCP1 及PRDM16 的表達水平，促進脂肪源性干細胞發生棕色化，及lncRNA ROR 通過表達參與TGF-β 信號通路過度激活，共同引起dWAT 過度減少從而加速面部皮膚的老化，既往有研究發現，lncRNA ROR在脂肪源性干細胞中過表達與面部皮膚老化的發生發展有顯著的相關性[22]。因此APG 聯合ADSCs可能通過改變lncRNA（DLX6-AS1、CHI3L1、CAMTA1、STRADB、ARAP1-AS1、ARAP1-AS2、PVT1、ROR）的表達，而影響炎癥因子和血管生成因子水平，而對DF 發揮降糖及治療作用，但本研究也存在局限性，如一個lncRNA 可調節多個靶基因，而靶基因也可受多個lncRNA 調節[23]，后期可繼續完善研究，為明確APG 聯合ADSCs 調控DF 的機制提供依據。

綜上所述，APG 聯合ADSCs 可能通過改變lncRNA DLX6-AS1、CHI3L1、CAMTA1、STRADB、ARAP1-AS1、ARAP1-AS2、PVT1、ROR 的表達，而對DF 大鼠的炎癥因子與血管生成因子水平產生影響，繼而發揮降糖及治療作用。