線粒體Higd 1a在新生兒缺氧缺血性腦損傷中的研究進展*

葉超群 黃會芝

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是新生兒期常見的嚴重神經系統疾病，無論是足月兒還是早產兒，都有較高的死亡率；此外，HIBD 也是兒童嚴重神經殘疾的主要原因。每年，全世界1.3 億新生兒中有400 萬嬰兒患有HIBD，其中有100 萬人死于腦損傷，存活下來的HIBD 嬰兒通常會遺留智力低下、腦癱、癲癇和其他功能障礙，嚴重影響了患兒的生活質量。這無論是對于患兒家庭還是社會而言，都是嚴重的創傷[1-2]。然而，HIBD 發病機制尚未完全明確，亞低溫是目前唯一公認有效的治療方案，但對于中重度腦損傷患兒的療效有限，仍有相當一部分患兒死亡或存在各種形式的后遺癥[3-5]，因此迫切需要新的治療策略。

缺氧誘導基因結構域蛋白-1a（hypoxia inducible gene domain family 1a，Higd 1a）又稱為HIG1 或HIMP1-a（hypoglycemia/hypoxia inducible mitochondrial protein 1）是一種存在于多種類型細胞線粒體的內膜蛋白，在真核生物中廣泛表達，包括真菌和人類。Higd 1a 最初在人工培養的人宮頸上皮細胞中被發現，遂被證明可以在富含神經元的原代培養基中被低氧誘導及在小鼠胚胎成纖維細胞中被鎳誘導[6-7]。近年來發現其在腦、心臟、結腸、腎和肝臟等組織中普遍表達，而在小鼠的小腦、額葉和皮質中表達水平尤為明顯。Higd 1a 由93 個氨基酸組成，分子量為10.6 kDa，等電點為9.8，基因定位于8 號染色體8q32，基因庫序列編碼AY062253，基因序列全長527 bp。Higd 1a 具有兩個跨膜區，它的兩個選擇性剪接產物（HIMP1-a 和HIMP1b）各自形成一個跨膜環，“U”形穿過線粒體內膜，并具有“N 端-C 端”方向，其N 端和C 端位于線粒體內膜外側。Higd 1a 受缺氧誘導因子-1（HIF-1）調控，主要由缺氧和低糖誘導表達，參與應激反應中的抗凋亡過程，并與微環境應激條件有關，其中也以缺氧最為多見。據報道，Higd 1a 具有調節線粒體內環境穩態功能，進而參與調節多種細胞內功能，如能量的產生、維持氧化還原穩態及鈣穩態、抗細胞凋亡等[8-9]。Higd 1a 在低氧條件下的抗細胞凋亡作用為新生兒缺氧缺血性腦病的治療提供了新的方向，故本文主要綜述Higd 1a 在新生兒缺氧缺血性腦損傷中的分子機制及Higd 1a 在缺氧缺血中的作用，并為Higd 1a 在新生兒缺氧缺血性腦損傷中的應用提供更有力的證據，為進一步探索腦缺氧缺血性損傷的治療提供新的靶向治療方案。

1 線粒體Higd 1a在缺氧缺血性腦損傷中的分子機制

缺氧缺血性腦損傷的具體機制尚不完全明確，興奮毒性、氧化應激、炎癥和細胞凋亡機制共同參與并最終導致腦損傷，線粒體損傷則貫穿整個損傷過程，并成為新生兒缺氧應激后的神經退行性變中的關鍵階段，與隨后誘導細胞死亡通路有關，是缺氧缺血損傷的關鍵標志[10-11]。當缺氧缺血時，腦細胞線粒體在缺氧早期即發生一系列不可逆性損傷，腦作為體內代謝最活躍的器官之一，較容易受到血氧供應不足的損害[12]。腦缺氧缺血發生后，腦內葡萄糖、糖原、三磷酸腺苷（ATP）和磷酸肌酸的濃度立即下降，并在缺血后10～12 min 幾乎完全耗盡。根據動物模型的缺氧缺血狀態的研究已證實，在缺氧缺血開始后的幾分鐘內即已出現不可逆的神經元損傷[13]。線粒體的結構、功能異常與腦缺氧缺血損傷的發生、發展關系密切，線粒體的損傷程度同時也提示了缺氧缺血性腦損傷的嚴重程度[14]。在缺氧缺血等應激條件下，腦細胞對能量的需求尤為明顯，而線粒體作為細胞能量代謝的中心，在腦細胞缺氧缺血損傷的過程中發揮著至關重要的影響，故而線粒體成為神經保護的主要目標[15]。有研究發現，Higd 1a 可以保護細胞免受低血糖和低氧誘導的細胞凋亡，延長細胞的存活時間，這提示Higd 1a 在線粒體應激保護中發揮重要作用[16]，Higd 1a 的高表達則提示了腦損傷的良好預后。

線粒體是細胞生物氧化和能量轉換的主要場所，為機體提供95%以上的能量，對維持細胞正常生理功能起著重要作用。然而線粒體卻是對損傷極為敏感的細胞器，其腫脹可由多種損傷因子引起，其中最常見的即為缺氧。Higd 1a 的表達是由缺氧誘導因子1（HIF-1）誘導，Higd 1a 可能在線粒體呼吸鏈中發揮多效性作用。暴露在18%和5%氧氣中的細胞之間的Higd 1a 蛋白水平沒有顯著差異，但在缺氧早期，Higd 1a 蛋白水平升高。可見線粒體Higd 1a 在腦缺氧缺血性損傷中的作用主要與氧化呼吸鏈有關，包括正向調節細胞色素C 氧化酶的產生及抑制氧氣消耗，降低細胞活性氧水平。近年來有研究發現中視神經萎縮相關蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）、γ 分泌酶復合體與Higd 1a 在缺氧條件下的表達相關，可能成為Higd 1a 在腦缺氧缺血性損傷中不可缺少的部分。

1.1 Higd 1a 與細胞色素C 氧化酶 細胞色素C 氧化酶（cytochrome c oxidase，CcO）是線粒體電子傳遞系統的末端成分，同時也是呼吸電子傳遞鏈的第四個中心酶復合物，因此又被稱為復合物Ⅳ（complex Ⅳ），是細胞耗氧的主要部位，也是以ATP的化學形式產生有氧能量所必需的[17]。一方面，Higd 1a 參與復合體Ⅳ的組裝，以形成呼吸超復合體[18]。另一方面，細胞色素C 與Higd 1a 結合，使血紅蛋白的親和力下降，由于CcO 是體內唯一一種可以利用氧氣進行能量傳遞的酶，因此也有研究認為CcO 的調節機制依賴于氧濃度[19]。Hayashi 等[20]在尋找一種由低氧驅動的CcO 調節因子的過程中發現Higd 1a 是CcO 的正調控因子，通過純化外源性Higd 1a 蛋白，建立ATP 敏感的熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）探針檢測內源性Higd 1a 蛋白的表達量，證明了通過內源性誘導Higd 1a 的表達及外源性增加Higd 1a 蛋白都可提高CcO 的表達量。該研究發現在Higd 1a 缺氧早期被瞬時誘導，直接連接并整合到CcO 大分子復合體中，并使CcO 的活性中心—血紅素a 的結構變化，進而調節氧化磷酸化過程，使ATP 的產生增加，從而保護細胞免受缺氧的影響。Higd 1a 是CcO的一個先前未知的調節成分，并且代表著與CcO 活性降低相關的疾病的治療靶點，為細胞的缺氧缺血性損傷提供新的治療方向。

1.2 Higd 1a 與活性氧（ROS）線粒體的關鍵功能是產生ATP，并作為細胞中的能量發生器，它們在需要高濃度ATP 的大腦和心臟組織中尤其重要。然而，高水平的ROS 是高ATP 產生的副產品。Li 等[21]研究發現在線粒體損傷時，高水平的ROS 可以通過上調PGC-1a 和HIF-1a 的表達來誘導Higd 1a 的表達，并通過幫助維持正常的線粒體功能來保護細胞免受缺氧的影響。另一方面，Higd 1a 基因敲除實驗表明，即使在常氧條件下，Higd 1a 缺失也會增加活性氧的產生，并損害線粒體的跨膜電位，誘導細胞凋亡。Guo 等[22]證明了在豬的支持細胞中，過表達的Higd 1a 可抑制ROS 的水平。此外，在缺氧和缺血期間，ROS 的大量產生與腦損傷之間有直接關系，而且與其他器官相比，Higd 1a 在大腦和心臟中的表達水平非常高。這表明Higd 1a 可能會抑制這些腦組織中過量的ROS 產生，并保護它們免受氧化應激的傷害。

1.3 Higd 1a 與OPA1 OPA1 基因屬于核基因，編碼的蛋白是線粒體內源發動蛋白，是線粒體塑形蛋白家族的成員。OPA1 蛋白有L 和S 兩種亞型，參與線粒體內膜融合，對線粒體形態結構有著重要的作用。OPA1 與呼吸作用復合物直接相關，作為呼吸鏈的一部分，保持呼吸鏈的完整性，參與呼吸作用和能量代謝，在細胞凋亡過程中則與早老素相關菱形樣（presenilin associated rhomboid like，PARL）蛋白以OPA1-PARL 復合體的形式發揮抗凋亡因子的作用。

An 等[23]實驗證明，Higd 1a 的N 端與OPA1 結合，進而保護OPA1 L 亞型免受誘導切割；Higd 1a沉默則導致L 亞型丟失，繼而線粒體脊裂解，線粒體DNA 丟失，細胞生長遲緩；然而，在細胞處于低氧條件（0.1%O2）下12 h，Higd 1a 過表達并延長OPA1 L 亞型的切割時長至6 h。由此可知，在正常條件下，Higd 1a 通過結構性表達保持OPA1 的完整性，而在缺氧條件下，它的過表達雖不能完全阻止OPA1 的切割，但通過推遲OPA1 的切割來緩解細胞壓力，維持線粒體完整性，進而幫助細胞抵抗缺氧損傷，這一研究發現為對抗缺氧性損傷提供了新的治療方向。

1.4 Higd 1a 與γ 分泌酶復合體 γ 分泌酶復合體是由四個亞單位組成的膜內蛋白水解酶，包括早老素（presenilin，PS）包括PS1 和PS2，中前咽缺陷蛋白-1（Aph-1），早老蛋白增強子-2（Pen-2）和Nicastrin，主要參與β-淀粉樣蛋白前體（APP）和Notch 蛋白等重要跨膜蛋白的切割和水解過程。Hayashi 等[24]從對γ 分泌酶抑制基因的篩選中分離到Higd 1a，并發現Higd 1a 的過表達可抑制γ 分泌酶活性。Higd 1a 與線粒體膜上的γ 分泌酶成分（PS1、Nicastrin、Aph-1 和Pen-2）直接結合，降低γ-分泌酶活性，從而減少ROS 的產生和線粒體功能障礙，此外，Higd 1a 的缺失增加了γ 分泌酶的激活，增強了缺氧所致的線粒體功能障礙。綜上所述，Higd 1a 過表達可使缺氧誘導的線粒體膜γ 分泌酶活性減低并減少細胞內β 淀粉樣蛋白的積聚，從而減輕缺氧引起的線粒體功能障礙，故Higd 1a是線粒體γ 分泌酶復合體的一種新的調節劑，并在維持正常線粒體功能方面發揮重要作用，是涉及線粒體損傷性疾病的潛在治療靶點。

1.5 Higd 1a 與caspase caspase 是一組存在于細胞質中的蛋白酶，與真核細胞凋亡密切相關，并參與細胞的生長、分化與凋亡調節。為了解缺氧和Higd 1a 過表達是否影響caspases 的激活，An 等[25]將穩定轉染Higd 1a 的巨噬細胞（RAW）在缺氧條件下培養6 d，并在指定的時間進行檢測，結果發現穩定轉染Higd 1a 的巨噬細胞（RAW）在低氧條件下比模型轉染細胞存活得更好，而將穩定表達caspase的巨噬細胞在caspase 抑制劑下培養6 d 也明顯減少了細胞凋亡。這證明了caspase 活性是由Higd 1a 通過底物和caspase 抑制劑來調節的。降低caspases的活性參與了Higd 1a 細胞在缺氧條件下的存活效應。

2 Higd 1a在缺氧缺血性疾病中的研究前景

Higd 1a 被發現在心臟、腦和肝臟組織中高度表達，在腎臟和骨骼肌中低水平表達[24]。Kurosh 等[26]實驗證明，內源性Higd 1a 是體內代謝應激的潛在標記物，常見于不同的病理狀態，如心肌梗死、缺氧缺血性腦損傷和不同類型的癌癥。可見Higd 1a在緩解缺氧缺血性組織損傷中有充分的理論證據。

外源Higd 1a 可以使低氧條件下斑馬魚線粒體中的呼吸鏈復合體Ⅳ（C-Ⅳ）的活性增加，CcO 活性增加，同時增加ATP 的合成，提高心臟對于缺氧的耐受性，并發揮器官保護作用。在斑馬魚的缺氧模型中，通過測量線粒體ATP 濃度，可以證明Higd 1a 的組織保護作用。心臟特異性Higd 1a的過度表達緩解了低氧條件下線粒體ATP 的下降，并保護了斑馬魚的心功能[19]。這一結果表明，通過Higd 1a 模擬物可以增加CcO 活性，可能有治療線粒體疾病的潛力，為缺血性、代謝性和線粒體疾病的治療提供選擇。

Higd 1a 可對抗葡萄糖饑餓并通過減少細胞凋亡來抑制腫瘤生長。Ameri 等[27]研究了Higd 1a 在多種人類癌細胞系中的調控模式，并發現在缺氧缺血最明顯的腫瘤壞死區域，代謝應激源觸發Higd 1a 的誘導表達，進而抑制腫瘤的生長。另一方面，Higd 1a抑制與乳腺癌治療后腫瘤復發相關，Higd 1a 抑制與乳腺癌治療后腫瘤復發相關，Higd 1a 會根據細胞在不同的應激條件下進而產生不同的效應，當嚴重缺氧的腫瘤細胞面臨葡萄糖剝奪時，DNA 甲基轉移酶的活性被抑制，促進Higd 1a 表達，對異常代謝環境適應，并誘導腫瘤細胞休眠[28]。這一發現為腫瘤細胞在極端環境的適應機制提供了新的見解，Higd 1a可能在腫瘤休眠或復發機制中發揮重要作用，調節缺氧腫瘤區域Higd 1a 活性可能有助于克服在抗血管生成或HIF 抑制所介導的腫瘤休眠。線粒體蛋白HIGD 家族的小分子調節劑為這一可能性提供了方向[29]。

Higd 1a 在新生兒缺氧缺血性損傷時定位于細胞核。免疫熒光顯微鏡顯示，在對照的新生兒腦中，內源性Higd 1a 主要在細胞核外少量表達；然而在缺氧缺血性腦損傷的新生兒腦內，內源性Higd 1a 的表達水平明顯升高[24]。Higd 1a 作為一種在應激反應中抗細胞凋亡的蛋白，在大鼠出生后的早期即廣泛分布于中樞神經系統，其表達量在大腦中的分布不同并隨個體年齡的變化而變化。Higd 1a 在海馬、丘腦核、梨狀內核和尾殼核高度表達，并隨著出生后年齡的增長，其表達量也逐漸增加。在嚴重應激期間，即在缺血性心臟病、缺氧缺血性腦病和癌癥的背景下，Higd 1a 從胞漿池移位到細胞核，且Higd 1a的核定位與應激的嚴重程度相關[30]。

綜上所述，Higd 1a 對于HIBI 后的線粒體損傷程度起到了明確的緩沖作用，Higd 1a 沉默會影響細胞融合。這些證據都提示了Higd 1a 的表達在HIBI中的研究價值，然而目前國內外尚沒有關于Higd 1a靶向治療HIBI 的報道，外源性Higd 1a 靶向治療HIBI 的療效值得進一步探究。