氨基甲酸酯類農(nóng)藥和抗生素對細(xì)菌的聯(lián)合毒性

陳森旺，馬欣怡，任敏慧，陳杭哲，張從洲，呂露，毛玉琴*

(1.浙江樹人學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021)

氨基甲酸酯類(CMs)農(nóng)藥因具有選擇性強(qiáng)、高效、廣譜、對人畜低毒、易分解和殘毒少的特點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、牧業(yè)等諸多領(lǐng)域[1]。CMs農(nóng)藥是從氨基甲酸衍生而來，是在有機(jī)磷酸酯之后發(fā)展起來的合成農(nóng)藥，常用的有4類：(1)萘基氨基甲酸酯類；(2)苯基氨基甲酸酯類；(3)氨基甲酸肟酯類；(4)雜環(huán)二甲基氨基甲酸酯類[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，CMs農(nóng)藥的使用量已超過有機(jī)磷農(nóng)藥，銷售額僅次于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，位居第二[3]。CMs農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的污染是多方面的，因此，研究典型CMs農(nóng)藥對細(xì)菌抗生素抗性的影響是極其重要的。CMs農(nóng)藥的大量使用，不可避免地造成農(nóng)藥殘留暴露于環(huán)境中，對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成潛在的風(fēng)險(xiǎn)[4-5]，導(dǎo)致果蔬等農(nóng)產(chǎn)品長期處在富含CMs農(nóng)藥的環(huán)境中，在一定程度上會發(fā)生基因突變。基因突變具有不定向性，部分突變可能為抗性突變，從而使細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生抗性。多項(xiàng)研究表明，CMs農(nóng)藥可以通過嵌插方式作用于DNA，形成DNA加合物，并造成DNA損傷[6-8]。DNA損傷則是導(dǎo)致基因突變發(fā)生的常見原因，而基因突變正是產(chǎn)生細(xì)菌抗生素抗性的根本途徑[9-10]。

抗生素是應(yīng)用于臨床的主要抗感染藥物，是一種具有廣譜抗菌作用的基礎(chǔ)用藥，抗生素的種類繁多且其使用量大，環(huán)境檢出率高，具有強(qiáng)大的抗菌作用，且在正常情況下抗生素不會對宿主本身造成影響，也不會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用[11]。所以人們首先選用抗生素來對抗微生物的感染，近年來，不僅是醫(yī)療行業(yè)，畜牧養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)行業(yè)及化妝品行業(yè)都在大量使用各類抗生素，而大量使用抗生素使環(huán)境中遺留了過量抗生素，這些過量的抗生素不僅對水體和土壤造成了一定的污染，也對蔬菜和果樹等農(nóng)作物有直接或間接的影響，對人體健康和生態(tài)環(huán)境有潛在威脅，會間接地對人類、環(huán)境等造成一些不可避免的危害。研究表明：環(huán)境中的抗生素抗性可以傳遞給臨床致病菌，從而威脅人類健康，這使得細(xì)菌抗生素抗性成為緊迫的環(huán)境問題[12-14]。環(huán)境污染多呈現(xiàn)復(fù)合污染的狀態(tài)，抗生素和農(nóng)藥常以混合污染物出現(xiàn)，混合污染物總表現(xiàn)出與單一污染物不同的毒性效應(yīng)，然而目前關(guān)于CMs農(nóng)藥和抗生素聯(lián)合毒性作用的研究還鮮有報(bào)道。基于此，本研究從常用的4類CMs農(nóng)藥中分別選取了1種農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用較廣泛的農(nóng)藥作為典型，以食源性致病菌——陰溝腸桿菌為模式細(xì)菌，研究不同類型CMs農(nóng)藥和抗生素的單一以及多重毒性效應(yīng)，通過計(jì)算抗性誘導(dǎo)率定量反映CMs農(nóng)藥對細(xì)菌抗生素抗性的誘導(dǎo)作用，明確不同類型CMs農(nóng)藥和不同抗生素之間的作用關(guān)系，為全面評估環(huán)境中CMs農(nóng)藥殘留和抗生素殘留的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供新思路和新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

甲萘威(萘基氨基甲酸酯類)、抗蚜威(苯基氨基甲酸酯類)、涕滅威(氨基甲酸肟酯類)和異丙威(雜環(huán)二甲基氨基甲酸酯類)購自上海市農(nóng)藥研究所有限公司。參考果蔬中最常檢出的致病微生物，選取陰溝腸桿菌亞種(Enterobactercloacaesubsp.Cloacae，ATCC 13047)作為受試菌株(簡稱“Ent菌株”)，購自廣東省微生物研究所。試驗(yàn)采用肉湯培養(yǎng)基(NB)對Ent菌株進(jìn)行活化，NB培養(yǎng)基購自鄭州萊浦生物科技有限公司。陰溝腸桿菌菌株測試所用抗生素左氧氟沙星(Lev)、諾氟沙星(Nor)、慶大霉素(Gen)和克拉霉素(Cla)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 染毒

取Ent凍存菌液10 μL加入30 mL NB營養(yǎng)肉湯，放置搖床上于180 r·min-1、37 ℃恒溫活化15 h。將過夜活化后的Ent菌液稀釋500倍至含有單一濃度的CMs農(nóng)藥及梯度濃度的抗生素的10 mL NB肉湯中接觸染毒，染毒時(shí)間根據(jù)PPDB數(shù)據(jù)庫中的DT50值，確定于37 ℃下振蕩培養(yǎng)48 h。另外設(shè)不加農(nóng)藥的相同量菌液做空白對照。

1.2.2 微生物毒性檢測

陰溝腸桿菌的毒性檢測采用紫外分光光度儀在波長600 nm處測定細(xì)菌活性來實(shí)現(xiàn)。用NB營養(yǎng)肉湯調(diào)零，將染毒菌液和空白對照用NB營養(yǎng)肉湯0.5∶2.5稀釋后，分別置于紫外分光光度儀測量吸光度，每組測3次，記錄每個(gè)梯度的吸光度，根據(jù)空白對照組的吸光度計(jì)算抑菌率，從而計(jì)算抗性誘導(dǎo)率(EOP)。EOP常被用于表征化學(xué)藥品對微生物非致死復(fù)合毒性效應(yīng)，計(jì)算公式[15]：

1.2.3 最小抑制濃度(MIC)值和半致死濃度(EC50)值的測定

根據(jù)染毒菌液的抑菌率查得生物統(tǒng)計(jì)機(jī)率值換算表中抗生素的機(jī)率值，再以抗生素濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、機(jī)率值為縱坐標(biāo)求得回歸直線方程。MIC和EC50的機(jī)率值分別為5和6.281 6，將MIC和EC50的機(jī)率值帶入回歸方程求得其濃度的對數(shù)值，再換算成MIC和EC50的濃度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素對陰溝腸桿菌的單一毒性

4種抗生素對陰溝腸桿菌的單一毒性劑量-效應(yīng)如圖1所示。4種抗生素對陰溝腸桿菌的抑制率均隨著濃度的增大而增大，最終抑制率趨向100%。本試驗(yàn)所用的Gen、Lev、Cla和Nor的最大濃度分別為4.0、0.5、60.0、1.8 mg·L-1。然后分別設(shè)置梯度濃度，測定抗生素濃度對陰溝腸桿菌毒性的作用，測定抗生素對陰溝腸桿菌單一毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

由圖1可知，Gen在所選定的濃度范圍內(nèi)抑菌率變化幅度最大，Lev和Nor在所選定的濃度范圍內(nèi)抑菌變化幅度較大，而Cla的濃度梯度最大而抑菌率變化幅度最小，在3.75 mg·L-1的濃度下抑菌率就已經(jīng)達(dá)到了近70%。Nor在最大濃度1.8 mg·L-1時(shí)抑菌率才剛達(dá)到50%。通過計(jì)算可得慶大霉素Gen、Lev、Cla和Nor的MIC值分別為1.77、2.39、146.64、31.53 mg·L-1，EC50值分別為0.46、0.10、0.74、1.61 mg·L-1。

圖1 抗生素對陰溝腸桿菌的單一毒性劑量-效應(yīng)曲線

2.2 CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌的單一毒性作用

確定試驗(yàn)所用抗蚜威(PMC)，甲萘威(CBY)，異丙威(IPC)，涕滅威(ADC)最高濃度分別為1 000、1 000、1 000、800 mg·L-1，然后設(shè)置梯度濃度，測定農(nóng)藥濃度對陰溝腸桿菌毒性的作用。農(nóng)藥對陰溝腸桿菌單一毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系如圖2所示。4種CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌的生長都產(chǎn)生了抑制作用，且抑制作用均隨著濃度的增大而逐漸增大，即抑制率隨著濃度的增大而逐漸升高。PMC對陰溝腸桿菌生長的抑制作用不明顯，抑制率隨著濃度的增大略有上升，在試驗(yàn)確定的最高濃度1 000 mg·L-1時(shí)只有近20%的抑菌率；ADC在最高濃度800 mg·L-1時(shí)抑菌率也沒有超過50%；CBY相比于其他3種農(nóng)藥其抑菌效果最明顯，在0.02 mg·L-1的濃度時(shí)就已達(dá)到20%的抑菌率。低濃度下，4種CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌的抑菌率都很低，對陰溝腸桿菌的抑制作用幾乎可以忽略不計(jì)。

圖2 CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌單一毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系

根據(jù)試驗(yàn)所測得的CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌單一毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線，CMs農(nóng)藥的MIC值遠(yuǎn)遠(yuǎn)要大于試驗(yàn)所選用的最高濃度，在本次試驗(yàn)的聯(lián)合毒性研究中所用的CMs農(nóng)藥濃度都固定在無可觀察效應(yīng)水平(NOEL)。無可觀察效應(yīng)水平定義為對EOP無影響的物質(zhì)的最高濃度，4種CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌的抑制率都在10%以內(nèi)，并且抑制率隨濃度的變化趨勢較為平緩(表1)。由此認(rèn)為，CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌的生長基本沒有促進(jìn)作用和抑制作用。

表1 CMs農(nóng)藥的NOEL和MIC值

2.3 CMs農(nóng)藥和抗生素對陰溝腸桿菌的聯(lián)合毒性作用

為了確定CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌抗生素抗性的影響作用，分別測定CMs農(nóng)藥染毒48 h后的陰溝腸桿菌對典型抗生素的抗性變化情況，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌抗生素抗性的劑量-效應(yīng)關(guān)系

根據(jù)抗生素濃度對陰溝腸桿菌的MIC值進(jìn)行適當(dāng)濃度的調(diào)整，以采用總突變率比值的對數(shù)值來表征CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌抗生素抗性的影響作用。如果聯(lián)合毒性的對數(shù)值大于單一毒性的對數(shù)值，說明CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌抗生素抗性有協(xié)同作用；如果聯(lián)合毒性的對數(shù)值小于單一毒性的對數(shù)值，說明CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌抗生素抗性有拮抗作用。

從圖3中可以看出，CMs農(nóng)藥結(jié)構(gòu)不同，對陰溝腸桿菌抗生素抗性的影響作用不盡相同，4種CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌抗生素抗性的劑量-效應(yīng)關(guān)系具有明顯的差異性。其中，4種CMs農(nóng)藥都對Lev的抗性增強(qiáng)，表現(xiàn)為協(xié)同作用，在濃度小于0.25 mg·L-1時(shí)，4種農(nóng)藥對陰溝腸桿菌抗生素抗性的上升程度按大小順序?yàn)榧纵镣?抗蚜威>涕滅威>異丙威，說明萘基類CMs農(nóng)藥對Lev的抗性增強(qiáng)效果最為顯著。

酯類CMs農(nóng)藥(涕滅威)染毒后陰溝腸桿菌對Nor和Gen的抗性呈下降趨勢，但對Nor的抗性變化并不明顯，表現(xiàn)為拮抗作用；而對Cla的抗性呈增強(qiáng)趨勢，表現(xiàn)為協(xié)同作用，且濃度越大，協(xié)同作用越顯著。萘基類CMs農(nóng)藥(甲萘威)和苯基類CMs農(nóng)藥(抗蚜威)染毒后陰溝腸桿菌對Cla的抗性均隨濃度的上升而下降，表現(xiàn)為拮抗作用，濃度越大，拮抗作用越顯著；而對Nor的抗性在濃度小于0.9 mg·L-1時(shí)抗性增強(qiáng)，表現(xiàn)為協(xié)同作用，在濃度大于0.9 mg·L-1后隨濃度升高抗性下降，表現(xiàn)為拮抗作用；甲萘威對Gen的抗性表現(xiàn)為協(xié)同作用，抗蚜威在濃度小于0.5 mg·L-1時(shí)，對Gen的抗性表現(xiàn)為拮抗作用，但拮抗效果并不明顯，當(dāng)濃度大于0.5 mg·L-1時(shí)，表現(xiàn)為協(xié)同作用，且濃度越大，協(xié)同作用越明顯。雜環(huán)類CMs農(nóng)藥(異丙威)對Cla的拮抗作用略乎其微，對Gen和Nor的抗性表現(xiàn)為協(xié)同作用，且對Gen的協(xié)同作用隨著濃度的升高越來越顯著，對Nor的協(xié)同作用在濃度為1.8 mg·L-1時(shí)最大。因此，在使用甲萘威和抗蚜威時(shí)特別需要注意其濃度的合理配制及使用。

3 小結(jié)

CMs農(nóng)藥單獨(dú)作用對陰溝腸桿菌的生長基本沒有抑制作用，無顯著毒性效應(yīng)。但CMs農(nóng)藥能改變陰溝腸桿菌的抗生素抗性，不同類型CMs農(nóng)藥對陰溝腸桿菌的抗生素抗性的影響不盡相同。4種CMs農(nóng)藥染毒后陰溝腸桿菌對Lev抗性均表現(xiàn)為協(xié)同作用，在濃度小于0.25 mg·L-1時(shí)，4種農(nóng)藥對陰溝腸桿菌抗生素抗性的上升程度按大小順序?yàn)榧纵镣?抗蚜威>涕滅威>異丙威。酯類CMs農(nóng)藥(涕滅威)染毒后陰溝腸桿菌對Nor和Gen的抗性表現(xiàn)為拮抗作用，萘基類CMs農(nóng)藥(甲萘威)和苯基類CMs農(nóng)藥(抗蚜威)染毒后陰溝腸桿菌對Cla的抗性表現(xiàn)為拮抗作用，而對Nor的抗性在濃度小于0.9 mg·L-1時(shí)抗性增強(qiáng)，表現(xiàn)為協(xié)同作用，在濃度大于0.9 mg·L-1時(shí)表現(xiàn)為拮抗作用。甲萘威對Gen的抗性表現(xiàn)為協(xié)同作用；抗蚜威在濃度小于0.5 mg·L-1時(shí)，對Gen的抗性表現(xiàn)為拮抗作用，但拮抗效果并不明顯，當(dāng)濃度大于0.5 mg·L-1時(shí)，表現(xiàn)為協(xié)同作用，且濃度越大，協(xié)同作用越明顯。雜環(huán)類CMs農(nóng)藥(異丙威)對Cla的拮抗作用略乎其微，對Gen和Nor的抗性表現(xiàn)為協(xié)同作用。

致病微生物的抗生素耐藥性會進(jìn)一步加重致病微生物對人體健康的威脅。基于本研究的結(jié)果，不同濃度的萘基類CMs農(nóng)藥(甲萘威)和苯基類CMs農(nóng)藥(抗蚜威)在田間施用后，對農(nóng)作物會有不一樣的影響作用，所以農(nóng)作物表面微生物的抗生素抗性問題需要密切關(guān)注。本研究結(jié)果提示對于農(nóng)藥的施用，除了關(guān)注其本身藥效、農(nóng)藥殘留外，還需考慮其對微生物的影響，這是對人類健康不容忽視的間接危害。對于部分確實(shí)會引起致病微生物的抗生素抗性提高的CMs農(nóng)藥，可以進(jìn)一步探索藥效好且對微生物耐藥性無影響的替代藥物。