柑橘GGP基因家族生物信息學分析

王平，柯甫志，徐建國

(浙江省柑橘研究所，浙江 臺州 318026)

抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)是一類重要的次生代謝產物，其主要作用是作為抗氧化劑和輔酶因子參與氧化還原反應，同時參與表觀遺傳激活[1-2]。AsA是人體必需的營養物質，人體自身無法合成，主要從果蔬中攝取。柑橘品種資源豐富，鮮果供應時間長，可滿足周年供應，已成為我國最大、全球第二大的消費水果，是人們日常生活獲取AsA的重要來源[3]。

植物中存在4條AsA生物合成途徑，擬南芥、番茄等植物突變體結果表明，L-半乳糖途徑是主導途徑[4-6]。GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GDP-L-galactose phosphorylase，GGP)，又名GDP-L-半乳糖轉移酶(GDP-L-galactose transferase，GGT)，催化GDP-L-半乳糖和L-半乳糖-1-磷酸之間的轉化，被認為是AsA生物合成途徑中的重要控制節點[7-9]。

GGP基因家族的全基因組鑒定與特點分析已在小麥中報道[10]。截至目前，GGP基因功能在柑橘中的研究僅局限于單個成員研究[3,11]，整個GGP基因家族的生物信息學分析還未見報道。本文通過柑橘已公布的全基因組信息和轉錄組數據，分析柑橘GGP蛋白質理化性質、二級結構、啟動子順式作用元件和轉錄組表達，為進一步確定柑橘GGP家族基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 染色體定位和序列分析

GGP基因家族序列、染色體定位信息來源于Phytozome數據庫。

1.2 蛋白質理化性質分析和亞細胞定位

蛋白質理化性質分析采用在線軟件(https://web.expasy.org/protparam/)進行。亞細胞定位分析采用在線軟件(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進行。

1.3 蛋白質二級結構分析

采用在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白質二級結構。

1.4 順式作用元件分析

從NCBI數據庫里獲取克里曼丁橘GGP基因家族編碼序列起始位點上游2 000 bp的序列，采用PlantCARE軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)分析啟動子區域順式作用元件，預測基因功能。

1.5 轉錄組數據分析

柑橘GGP基因家族的轉錄組數據來自http://citrus.hzau.edu.cn在線數據庫。

2 結果與分析

2.1 柑橘GGP基因家族染色體定位和序列分析

從Phytozome數據庫公布的克里曼丁橘全基因組中鑒定到4個GGP家族成員，分別命名為CsGGP1～CsGGP4。通過染色體定位發現，CsGGP1、CsGGP2、CsGGP3和CsGGP4分別位于9號、1號、6號和2號染色體上，除了CsGGP1外，其他3個成員都是全長基因；4個成員的序列長度介于921～1 368 bp，內含子數4～6個(表1)。

表1 柑橘GGP基因家族染色體定位和序列分析

2.2 柑橘GGP基因家族蛋白信息

4個基因家族序列通過Expasy在線軟件分析，蛋白質氨基酸個數在307～455個，相對分子量在35 021 440～50 540 620，等電點在 5.03～6.87；4 個成員均為不穩定蛋白質，不穩定指數在 41.35～53.20；脂溶指數89.14～96.19；4個家族成員的疏水性稍有差異，除CsGGP4為正值外，其他3個成員均為負值(表2)。

表2 柑橘GGP基因家族理化性質和亞細胞定位

亞細胞定位結果顯示，柑橘GGP 4個家族成員存在差異，CsGGP1分布于細胞核，CsGGP2和CsGGP3位于細胞質，而CsGGP4分布于細胞膜。

蛋白質二級結構分析得出柑橘GGP基因家族主要的二級結構是無規則卷曲和α-螺旋，分別占39%以上和33%以上；其次是延伸鏈，占16%以上；最后是β-轉角，占5%左右(表3)。

表3 柑橘GGP基因家族蛋白二級結構分析

2.3 柑橘GGP基因家族順式作用元件分析

對柑橘 GGP基因家族啟動子區上游2 000 bp的序列進行順式作用元件分析，結果如表4顯示，4個家族成員的啟動子區域均含有與光響應、脫落酸和茉莉酸甲酯響應元件，其中光響應元件個數最多，最高達到20個；不同成員還具有水楊酸、赤霉素和生長素等其他激素信號傳導、逆境脅迫(厭氧、低溫等)與植物生長發育等結合位點。

表4 柑橘GGP基因家族順式作用元件分析

2.4 柑橘GGP基因家族轉錄組分析

柑橘4個GGP基因家族成員在組織特異性、果皮發育和黃龍病(Huanglongbing，HLB)脅迫中表現不同(圖1和圖2)。4個成員中，CsGGP2在胚珠、果肉、葉片和須根等被測樣品中均高表達，尤其在果肉中，但在須根中的表達量顯著低于其他組織，不到果肉的1/10；CsGGP4成員在胚珠、葉片和須根中表達較高，尤其在須根中與CsGGP2表達量相當；CsGGP1和CsGGP3在被測樣品表達量均很低。隨著果皮發育，CsGGP2表達量呈現下降趨勢。須根HLB感染后，CsGGP2和CsGGP4表達量均增加。

圖2 柑橘4個GGP家族成員不同組織和HLB感染后的轉錄組表達

3 討論

本研究在克里曼丁橘全基因組范圍鑒定出 GGP 家族 4個成員，分別位于4條不同染色體上，亞細胞定位分布于細胞核、細胞質和細胞膜中。啟動子順式作用元件預測4個柑橘GGP基因家族成員均含有大量光響應相關的作用元件，尤其是CsGGP2和CsGGP4。研究顯示，AsA作為電子載體或供體參與光合作用[12-13]，且L-半乳糖生物合成途徑與光合作用緊密相關[1]；擬南芥AsA合成量和GGP表達均受高光逆境誘導[4,14]，這些結果均表明，GGP基因家族涉及光響應。

轉錄組分析數據顯示，CsGGP2成員表達量在被測組織均最高，表明CsGGP2是L-半乳糖生物合成途徑中的主導成員；CsGGP2在果皮發育過程中呈現下降趨勢，猜測CsGGP2參與柑橘果皮早期發育，這與L-半乳糖生物合成途徑被認為在葉片、綠果等綠色組織中起主要作用的研究結果一致[3-4,15]。須根感染黃龍病后，CsGGP2和CsGGP4表達均增加，表明CsGGP2和CsGGP4參與黃龍病逆境脅迫。