不同品種礬根組培快繁生長(zhǎng)對(duì)比試驗(yàn)

陳芳芳，陳相濤*，王方，李鋅

(1.杭州木木生物科技有限公司,浙江 杭州 311300；2.杭州市臨安區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,浙江 杭州 311300)

礬根(Heucheramirantha)，又名珊瑚鈴，為虎耳草科礬根屬多年生草本植物，原產(chǎn)于美洲中部，具有喜半蔭耐全光、耐旱性和耐寒性等生理特性[1]。礬根品種繁多，每個(gè)品種具有不同的葉色和獨(dú)特的葉形，且不同的季節(jié)、環(huán)境和溫度下葉片的顏色還會(huì)有豐富的變化，具有良好的觀賞性和景觀效果。目前，礬根是我國(guó)國(guó)內(nèi)熱門(mén)研究的園林景觀植物之一，在林下地被、庭院色塊中具有廣泛的應(yīng)用[2-3]。另外，礬根深受家庭園藝小型花卉愛(ài)好者的喜愛(ài)，園藝需求量逐漸增加。

礬根的傳統(tǒng)繁殖方式有播種、葉插和分株。只有部分礬根品種可以通過(guò)播種的方式繁殖，但不能很好地保留母本性狀，并且繁殖周期相對(duì)較長(zhǎng)，種子發(fā)芽慢且不整齊[4]；葉插和分株繁殖方式受季節(jié)和原材料的限制，繁殖速度慢，不能滿足市場(chǎng)需求。組培快繁技術(shù)具有條件可控、生長(zhǎng)周期短、繁殖系數(shù)高、能夠保持植物的優(yōu)良性狀、提高勞動(dòng)生產(chǎn)效率等優(yōu)點(diǎn)。因此，建立組織培養(yǎng)快速繁殖體系是解決礬根優(yōu)良品種種苗短缺的最有效途徑。

在對(duì)多個(gè)礬根品種的組培快繁試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同品種在增殖期間的激素用量差異比較大，針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，本論文以金秋和黑曜石2個(gè)品種為例，做激素對(duì)比試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年春季，在木木生物基地的育苗棚內(nèi)，隨機(jī)選取生長(zhǎng)健壯、性狀優(yōu)良的礬根幼苗的頂芽作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體的篩選

從4月下旬到6月下旬，每15 d采1次外植體，采集無(wú)病蟲(chóng)害的幼嫩植株的頂芽作為外植體。帶回實(shí)驗(yàn)室的外植體用洗潔精清洗表面的塵土，流水沖洗30 min，將外植體轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，用70%乙醇清洗10 s左右，用無(wú)菌水清洗3次，再用0.1%升汞溶液浸泡4～5 min，并輕輕攪動(dòng)，用無(wú)菌水漂洗5次，取出后用無(wú)菌濾紙吸干多余水分后備用。將消毒后的外植體接種至基本培養(yǎng)基(MS)+6-芐氨基嘌呤(6-BA)0.5 mg·L-1+萘乙酸(NAA)0.1 mg·L-1培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每瓶培養(yǎng)基接種1個(gè)頂芽，每次接種50瓶。

1.2.2 繼代培養(yǎng)基的篩選

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同類(lèi)型及濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：(1)MS；(2)MS+0.1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA；(3)MS+0.3 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA；(4)MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA；(5)MS+1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。每種培養(yǎng)基連續(xù)繼代3次，每次接種50 d后調(diào)查不同處理的生長(zhǎng)情況。繼代培養(yǎng)基添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂5 g·L-1，pH5.8～6.2。培養(yǎng)條件：室溫(25±1)℃，光照時(shí)間12 h·d-1，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx。

1.2.3 生根培養(yǎng)基的篩選

將繼代培養(yǎng)所得的生長(zhǎng)狀態(tài)最優(yōu)的試管苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同類(lèi)型及濃度的生長(zhǎng)素:(1)1/2MS；(2)1/2MS+0.1 mg·L-1吲哚丁酸(IBA)；(3)1/2MS+0.5 mg·L-1IBA；(4)1/2MS+1.0 mg·L-1IBA；(5)1/2MS+0.1 mg·L-1NAA；(6)1/2MS+0.5 mg·L-1NAA；(7)1/2MS+1 mg·L-1NAA。每瓶培養(yǎng)基接種6棵，每次接種50瓶，50 d后調(diào)查各處理的試管苗生根情況。生根培養(yǎng)基添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂5 g·L-1，pH 5.8～6.2。培養(yǎng)條件：室溫(25±1)℃，光照時(shí)間12 h·d-1，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx。

1.2.4 煉苗和移栽

生長(zhǎng)健壯的瓶苗擺放至大棚煉苗1周左右，移栽前3 d打開(kāi)瓶蓋，期間注意大棚溫度與濕度。移栽時(shí)將組培苗從瓶?jī)?nèi)取出，小心清洗根部基質(zhì)，1 000倍多菌靈浸泡消毒，栽于消毒過(guò)的蛭石和草炭(1∶1)混合基質(zhì)中，搭小拱棚或覆膜培養(yǎng)。期間保持濕度80%以上，溫度22 ℃左右，每7～8 d噴施1次1 000倍多菌靈殺菌，以防止真菌滋生，侵害弱苗。2周左右去掉薄膜，保持較弱光照培養(yǎng)，適當(dāng)通風(fēng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采樣時(shí)間對(duì)外植體成活率的影響

不同日期采樣對(duì)外植體的污染率和發(fā)芽率有較大的影響(表1)。從4月下旬開(kāi)始，隨著氣溫的升高，自然界中細(xì)菌的數(shù)量和活躍度也在逐漸增加，這使得外植體的污染率也逐漸增加。試驗(yàn)結(jié)果顯示，4月下旬外植體的污染率在20%以下，6月上旬達(dá)到58%～65%；4月下旬外植體的發(fā)芽率為80%～90%，6月上旬僅為30%～40%。因此，綜合考慮污染率和發(fā)芽率，最佳的外植體取材時(shí)間為4月下旬至5月上旬。

表1 外植體不同采樣時(shí)間的污染率和發(fā)芽率

2.2 不同濃度6-BA對(duì)礬根增殖培養(yǎng)及壯苗培養(yǎng)的影響

接種后30 d，統(tǒng)計(jì)不同濃度激素處理對(duì)叢芽繼代增殖的影響。從表2可見(jiàn)，金秋叢芽繼代增殖的培養(yǎng)基以MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1為最佳，苗的長(zhǎng)勢(shì)健壯，無(wú)明顯玻璃化情況，增殖倍率為3～5倍；而黑曜石叢芽繼代增殖的培養(yǎng)基以MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1為最佳，苗幾乎沒(méi)有玻璃化現(xiàn)象。

表2 礬根在不同激素濃度下增殖培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況

2個(gè)品種的礬根組培苗在同一激素濃度的培養(yǎng)基內(nèi)繼代2次以上，會(huì)出現(xiàn)增殖倍數(shù)增加、苗整體幼小并有玻璃化現(xiàn)象，為維持組培苗的狀態(tài)健康，需要在每次繼代時(shí)調(diào)整激素的用量和比例。通過(guò)多次的繼代和跟蹤記錄發(fā)現(xiàn)，繼代5次以?xún)?nèi)的苗，可通過(guò)繼代降低6-BA的用量和提高NAA的比例來(lái)達(dá)到壯苗的效果；繼代5次以上時(shí)，較低的激素濃度同樣對(duì)苗的增殖倍數(shù)和苗的狀態(tài)影響很大，這種情況下，需通過(guò)無(wú)激素培養(yǎng)以達(dá)到壯苗的目的。

增殖倍數(shù)高的苗在增殖期間可大大提高擴(kuò)繁效率，但不利于生根階段和移栽階段生長(zhǎng)。植物體內(nèi)積累的6-BA導(dǎo)致在生根培養(yǎng)時(shí)依然在發(fā)叢芽，移栽的死亡率很高。尤其是金秋，在低濃度6-BA培育條件下，依然表現(xiàn)出5倍以上的增值率，并經(jīng)過(guò)2次無(wú)激素培養(yǎng)才達(dá)到壯苗的效果。因此，在培養(yǎng)不同品種的礬根時(shí)需差別對(duì)待。

2.3 不同濃度IBA和NAA對(duì)礬根生根培養(yǎng)的影響

1/2MS培養(yǎng)基分別加入2種生長(zhǎng)素，2個(gè)品種礬根在這2種生長(zhǎng)素的生根情況比較相似，隨著生長(zhǎng)素濃度的增加生根情況越好，當(dāng)2種激素添加濃度均為1.0 mg·L-1時(shí)，表現(xiàn)為生根數(shù)量多，根長(zhǎng)，根系生長(zhǎng)健壯，全部生根(表3,圖1)。

表3 礬根在不同激素濃度下生根培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況

圖1 礬根金秋(左)和黑曜石(右)的生根培養(yǎng)

2.4 瓶苗移栽

煉苗后的生根苗，在前2周的培養(yǎng)中保持濕度80%以上，溫度22 ℃左右，成活率在70%以上。組培苗的健壯程度很大程度上決定了移栽成活率，因此，在組培苗的后期，提高瓶苗本身的健壯程度尤為重要。

3 討論

以采集的礬根頂芽作為外植體較適宜。在4—6月，隨著氣溫的升高，植物的內(nèi)生菌逐漸活躍，外植體的污染率將會(huì)逐漸增加，外植體采集以5月中旬以前為宜。為了降低外植體的污染率，可提前將礬根種植于經(jīng)過(guò)消毒處理的基質(zhì)中。良好的土壤和生長(zhǎng)環(huán)境，有利于培養(yǎng)低內(nèi)生菌的母本，植株生長(zhǎng)越旺盛，新生組織內(nèi)生菌的含量以及比例就越低，從而外植體的污染率也會(huì)少很多。

研究表明，6-BA濃度和繼代次數(shù)與組培苗玻璃化有密切的關(guān)系。6-BA濃度越高，繼代次數(shù)越多，玻璃苗的比率也越多[5-10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，金秋在6-BA濃度為0.3 mg·L-1時(shí)開(kāi)始表現(xiàn)玻璃化，黑曜石在高于0.5 mg·L-1時(shí)出現(xiàn)玻璃化傾向。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明2個(gè)問(wèn)題，一是不同品種礬根的自身組織分化能力有所不同；二是礬根的內(nèi)源激素水平普遍較高，因而較低濃度外源激素即可促進(jìn)繼代增生。金秋在組培過(guò)程比較容易出現(xiàn)玻璃化，經(jīng)多次繼代的組培苗，對(duì)激素的敏感度會(huì)顯著增加，需要在每次繼代時(shí)降低6-BA的濃度，甚至不加激素，以避免玻璃化的發(fā)生；相對(duì)金秋而言，黑曜石對(duì)激素的耐受程度明顯高一些，多次的繼代培養(yǎng)中，玻璃化情況很少出現(xiàn)。

6-BA的積累在一定程度上抑制生長(zhǎng)素，生根培養(yǎng)前經(jīng)過(guò)空白培養(yǎng)基培養(yǎng)的礬根組培苗，根系生長(zhǎng)更好。在叢芽的狀態(tài)下生根，苗弱小，芽不健壯，移栽過(guò)程中容易受傷，也容易受到微生物的侵害，成活率會(huì)大大下降。在培養(yǎng)過(guò)程中，尤其是金秋的組培苗，需要及時(shí)調(diào)整激素用量，并通過(guò)提高光照強(qiáng)度來(lái)增加其健壯程度，避免錯(cuò)過(guò)移栽的最佳時(shí)節(jié)。