結直腸癌組織中高遷移率蛋白族1與血管內皮生長因子、微血管密度的相關性研究

王寶良, 張 玲, 陳鐵良, 吳家劍, 楊立群, 董智剛

(河北省唐山市協和醫院, 1. 病理科, 2. 普通外科, 3. 麻醉科, 河北 唐山, 063000;4. 河北省唐山市豐南區醫院 普通外科, 河北 唐山, 063300;5. 華北理工大學附屬醫院 普通外科, 河北 唐山, 063000)

結直腸癌又稱大腸癌，包括結腸癌和直腸癌，是消化道最常見的惡性腫瘤，具有較高的發病率和病死率。調查[1]顯示，不良的生活習慣和不合理的飲食結構可能會破壞腸道微生物穩態，增加結直腸癌的發生風險。相關研究[2]稱，淋巴結轉移的發生可能會促進結直腸癌的復發，而20%～25%的結直腸癌患者可能在首次確診時即被發現有轉移。因此，有效控制淋巴結轉移才能降低結直腸癌的復發風險。淋巴結轉移過程可能與病灶及其周圍血管生成有關，且新生血管是癌細胞轉移的條件之一，故控制病灶及其周圍血管生成可以有效抑制癌癥發展[3]。研究[4-5]顯示，血管內皮生長因子(VEGF)可促進血管生成，微血管密度(MVD)可對血管生成程度進行可視化觀察，兩者或可作為診斷血管生成的重要指標。此外，血管生成和癌細胞浸潤遷移的微環境中還伴有一定的炎癥反應，例如高遷移率蛋白族1(HMGB1)作為一種炎性介質可能也參與了血管生成過程。本研究觀察結直腸癌患者癌組織中HMGB1、VEGF和MVD表達情況，并探討HMGB1與VEGF、MVD的相關性，以期為臨床診治結直腸癌提供一定參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2020年1月—2021年11月唐山市協和醫院收治的89例結直腸癌患者作為研究對象。納入標準: ① 經病理學檢驗確診結腸癌或直腸癌者; ② 參照《世界衛生組織消化系統腫瘤分類(2019年版)》[6], 腫瘤分型為腺癌者; ③ 參照美國癌癥聯合會TNM分期系統(第8版)[7], 癌癥分期為ⅡB～ⅢC期者; ④ 預計生存期>1年，美國東部腫瘤協作組(ECOG)體力狀況評分≤2分，卡氏功能狀態評分(KPS)≥60分者; ⑤ 對本研究知情同意者。排除標準: ① 有其他部位腫瘤史、腫瘤家族史者; ② 近期接受結直腸癌系統性治療者; ③ 近期服用影響免疫系統和凝血造血系統的藥物者; ④ 有嚴重實質性組織器官功能損傷或凝血造血功能障礙者; ⑤ 合并認知障礙或精神性疾病者。

1.2 主要材料與儀器

HMGB1一抗為兔多克隆HMGB1抗體，購于上海碧云天生物技術有限公司，貨號AF0180; VEGF一抗為鼠單克隆VEGF抗體, MVD可用CD34陽性表達情況表示, CD34一抗為鼠單克隆抗體，VEGF、CD34抗體均購于北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號分別為ZM-0265、ZM-0046。二抗、鏈霉親和素-生物素復合物及顯色劑為二步法通用試劑盒(小鼠/兔超敏聚合物法檢測系統)，購于北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號PV-8000D。牛血清白蛋白購于北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號ZLI-9027。主要儀器包括脫水機(型號EXCELSIORES, 賽默飛)、包埋機(型號Arcadia H，徠卡)、手動輪轉式石蠟切片機(型號RM2245，徠卡)、展片機(型號ZPJ-IA, 愛華)、烤片機(型號KPJ-IA, 愛華)和生物顯微鏡(型號BX53, 奧林巴斯)。

1.3 組織染色方法

取結直腸癌患者手術切除的癌組織及癌旁組織，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切成厚度為4 μm的多張切片。在同源組織切片中隨機選取1張作為陰性對照，使用二甲苯和梯度乙醇(100%乙醇5 min, 100%乙醇5 min, 90%乙醇 5 min, 80%乙醇 3 min, 70%乙醇 2 min)對所有切片進行脫蠟，用清水沖洗2次后，加入乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖溶液(pH值8.0)中，高壓鍋修復抗原，暴露抗原位點，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗2次, 5 min/次，用免疫組化筆畫出染色范圍，使用牛血清白蛋白封閉切片中非特異性的抗原位點，加入一抗，陰性對照切片不加抗體，與其他陽性對照切片一同放置于4 ℃環境下過夜。切片用磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次, 5 min/次，加入二抗, 37 ℃下孵育30 min, 重復磷酸鹽緩沖溶液沖洗操作，加入鏈霉親和素-生物素復合物(用磷酸鹽緩沖溶液稀釋100倍)，再重復磷酸鹽緩沖溶液沖洗操作，加入顯色劑，清水沖洗后用蘇木素復染30 s, 最后與脫蠟過程相反操作逆濃度梯度脫水，用中性樹膠封片。

1.4 染色觀察方法

① HMGB1和VEGF的染色觀察: HMGB1主要分布于細胞核, VEGF主要分布于細胞核和細胞質，染色程度可分為無色(0分)、淡棕色(1分)、棕色(2分)、棕褐色(3分)，染色范圍可分為<5%(0分)、5%～<20%(1分)、20%～<50%(2分)、≥50%(3分)，陽性評分=染色程度評分+染色范圍評分[8], 評分越高表示陽性程度越高。② MVD的染色觀察: CD34分布于細胞質，細胞質內出現棕黃色顆粒即為陽性。先在低倍鏡下尋找到新生血管最密集區，然后切換至200倍視野，選取5個視野，按照MVD計數標準(明顯著色的單個內皮細胞或細胞叢，或管腔直徑小于50 μm的管狀結構，均計數為1條微血管)對微血管染色數目進行計數，取平均值作為該切片樣本的MVD結果[9]。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 結直腸癌患者癌組織與癌旁組織中HMGB1、VEGF和MVD表達情況比較

根據是否發生淋巴結轉移，將89例結直腸癌患者分為轉移組32例和未轉移組57例。2組患者癌組織中的HMGB1陽性評分、VEGF陽性評分和MVD均高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05); 轉移組患者癌組織、癌旁組織中的HMGB1陽性評分、VEGF陽性評分和MVD均高于未轉移組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者癌組織與癌旁組織中HMGB1、VEGF和MVD表達情況比較

2.2 最佳截斷值

ROC曲線結果顯示，癌組織中HMGB1、VEGF和MVD診斷淋巴結轉移的最佳截斷值分別為陽性評分4.5分、陽性評分3.5分和平均每個200倍視野32.5條，即HMGB1陽性評分>4.5分、VEGF陽性評分>3.5分、MVD平均每個200倍視野>32.5條可視為高表達, HMGB1陽性評分≤4.5分、VEGF陽性評分≤3.5分、MVD平均每個200倍視野≤32.5條可視為低表達。見表2。

表2 癌組織中HMGB1、VEGF和MVD診斷結直腸癌患者淋巴結轉移的最佳截斷值

2.3 單因素分析

根據癌組織中VEGF陽性表達情況，將89例結直腸癌患者分為VEGF高表達組(陽性評分>3.5分)50例和VEGF低表達組(陽性評分≤3.5分)39例; 根據癌組織中MVD, 將89例結直腸癌患者分為MVD高表達組(平均每個200倍視野>32.5條)32例和MVD低表達組(平均每個200倍視野≤32.5條)57例。VEGF高表達組與VEGF低表達組、MVD高表達組與MVD低表達組在性別、年齡、體質量指數、病程、腫瘤最大直徑、腫瘤部位、腫瘤分型方面比較，差異均無統計學意義(P>0.05); VEGF高表達組、MVD高表達組淋巴結轉移者占比、HMGB1高表達者占比均分別高于VEGF低表達組、MVD低表達組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 結直腸癌患者VEGF、MVD表達情況的單因素分析

2.4 癌組織中HMGB1與VEGF、MVD的相關性分析

相關性分析結果顯示，結直腸癌患者癌組織中HMGB1陽性評分與VEGF陽性評分、MVD呈正相關(r=0.470、0.594,P<0.001)。

2.5 癌組織中HMGB1與VEGF、MVD的回歸性分析

以癌組織中HMGB1陽性評分為因變量，以癌組織中VEGF陽性評分和MVD為自變量，分別建立癌組織中HMGB1與VEGF、MVD的線性回歸方程。方程為yVEGF=2.459+0.516xHMGB1和yMVD=-17.365+13.502xHMGB1, 即HMGB1陽性評分每增加1分, VEGF陽性評分將增加0.516分, MVD將增加13.502條/視野。見表4。

表4 結直腸癌患者癌組織中HMGB1與VEGF、MVD的回歸性分析

3 討 論

結直腸癌淋巴結轉移可能導致腫瘤發展或疾病復發，其轉移過程伴隨著血管生成和炎性反應[10]。HMGB1是一種結構相對保守的核蛋白，在炎癥反應中發揮促炎性介質的作用，其還可作為一種促血管生成因子，促進新血管生成。相關研究[11]稱，結直腸癌患者癌組織中HMGB1升高會激活內皮細胞VEGF, 從而促進血管生成。另有研究[12]報道，高濃度HMGB1對缺血性疾病實驗動物模型具有較好的治療效果，提示HMGB1可以刺激內皮細胞釋放VEGF等血管生成因子，并增強內皮細胞增殖和遷移能力，有效促進動脈血管生成。內皮細胞是血管內壁的主要結構，在血管生成和淋巴結轉移中發揮重要作用[13]。癌癥患者體內HMGB1過表達可能活化病灶及其周圍內皮細胞，導致周圍血管生成和淋巴結轉移。

本研究結果顯示，轉移組患者癌組織與癌旁組織中的HMGB1陽性評分、VEGF陽性評分和MVD均高于未轉移組，且轉移組、未轉移組患者癌組織中的HMGB1陽性評分、VEGF陽性評分和MVD均高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。分析可能原因，癌細胞在原發灶增殖后進入淋巴管和血管中，附著于內皮細胞游走至近端或遠端，實現淋巴結轉移，同時癌細胞具有較強的營養掠奪能力和侵襲能力，而新血管生成能在一定程度上增加癌細胞增殖分化所需的營養供給。

本研究中, ROC曲線分析結果顯示，癌組織中HMGB1、VEGF和MVD診斷淋巴結轉移的最佳截斷值分別為陽性評分4.5分、陽性評分3.5分和平均每個200倍視野32.5條; VEGF高表達組、MVD高表達組淋巴結轉移者占比、HMGB1高表達者占比均分別高于VEGF低表達組、MVD低表達組，差異有統計學意義(P<0.05); 癌組織中HMGB1陽性評分與VEGF陽性評分、MVD呈正相關，線性回歸方程為yVEGF=2.459+0.516xHMGB1和yMVD=-17.365+13.502xHMGB1。HMGB1與血管生成相關指標VEGF、MVD均顯著相關，進一步說明HMGB1表達可能影響結直腸癌患者病灶及其周圍新血管的生成，促進淋巴結轉移。HMGB1在胞外能激活細胞外信號調節激酶和信號通路，促進內皮細胞生長、增殖和新血管生成，在胞內能與內皮細胞溶酶體融合，誘導內皮糖蛋白釋放而推動細胞增殖，促進血管生成。血管生成情況可用MVD值進行量化[14], MVD較高的惡性腫瘤患者癌組織中HMGB1呈高表達，其中結直腸癌患者體內HMGB1和VEGF均呈高表達狀態。VEGF具有促進血管通透性增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移與增殖和血管形成等作用，而HMGB1具有一定程度的促血管生成作用，這類促血管生成因子可促進結直腸癌病灶及其周圍血管生成，增加淋巴結轉移的發生風險。另外，隨著炎癥與免疫環境的失衡，結直腸癌腫瘤間質中出現活化M2型巨噬細胞，該類型細胞活化可能會誘導癌組織周圍正常細胞發生上皮間質轉化，促進癌細胞侵襲、浸潤和腫瘤血管生成。惡性腫瘤動物模型研究[15]顯示, HMGB1過表達會誘導巨噬細胞從M1型轉化為M2型，而后者也會釋放HMGB1, 進一步加劇炎癥反應。同時，過度炎癥反應還會誘導內皮細胞釋放VEGF等促血管生成因子，進一步促進血管生成。因此, HMGB1過表達可能促進炎癥反應，加速血管生成，推動淋巴結轉移。

綜上所述，結直腸癌患者癌組織中HMGB1、VEGF、MVD均呈高表達狀態，且HMGB1表達與 VEGF、MVD顯著相關。臨床醫師通過HMGB1檢測結果可在一定程度上評估結直腸癌患者腫瘤部位血管新生情況，可有效預防淋巴結轉移。