竹節參總皂苷通過腎素-血管緊張素系統抑制腎癌細胞增殖的研究

茹松甲, 劉曉麗, 李勝超

(遼寧省撫順市中醫院 腎內科, 遼寧 撫順, 113006)

竹節參總皂苷(TPJS)是五加科植物竹節參中的主要活性成分，是一種常用中藥，對心血管系統、免疫系統及中樞神經系統具有廣泛的藥理作用，被認為對許多人類癌癥具有有效的抗腫瘤特性[1]。腎素-血管緊張素系統(RAS)是人體重要的內分泌系統[2], 可調節血壓和電解質平衡。研究[3]表明, RAS可能參與許多病理生理過程，例如維持血壓/血容量穩態和離子液體平衡、系統發育進程、生長促進和血管生成、個體發育和系統發育。研究[4]表明，RAS在癌癥的發展中也扮演著重要的角色。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是已知的RAS通路的主要效應器，在調節癌癥炎癥和腫瘤血管生成中具有重要的作用[5]。AngⅡ1型受體(AT1R)介導的AngⅡ活性在調節RAS途徑中發揮中心作用[6-7]。RAS通路主要通過血管緊張素轉化酶-AngⅡ-AT1R軸發揮作用，可促進腎癌形成、增殖及轉移[8]。血管內皮生長因子(VEGF)和表皮生長因子受體(EGFR)是腫瘤相關血管生成中的重要分子，具有激活內皮細胞轉移并增加血管通透性的作用[9-10]。環氧合酶-2(COX-2)是一種參與癌癥發生和腫瘤進展的關鍵酶，尤其是在新生血管生成和淋巴血管侵襲中[11], 并且通過不同于VEGF軸的機制也被檢測到表達上調[12]。目前，關于TPJS抑制腎癌細胞系增殖和誘導其凋亡的作用機制的研究較少。本研究檢測RAS中AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2的表達水平，并分析其可能的作用機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和TPJS處理

人腎癌ACHN和A498細胞株購自廣州詹尼歐生物科技有限公司。ACHN細胞培養在添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養基中。A498細胞培養在含10%FBS的RPMI 1640培養基中。2種細胞系均在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。TPJS由中山大學生命科學院天然產物實驗室提供，并通過標準品檢測。TPJS在DMSO中溶解，并在測定中將DMSO稀釋1 000倍，最終DMSO最大濃度為0.1%, 并排除DMSO自身對細胞的影響，形成濃度為100 mmol/L的原液，隨后在培養基中稀釋至實驗所需的濃度。

1.2 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

TPJS處理ACHN和A498細胞后，在4 ℃下400×g離心15 min后收集培養液，在80 ℃下保存液體上清液進行ELISA。ACHN、A498細胞細胞溶解于十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解緩沖液中，隨后測定總蛋白提取液中AngII、AT1R、VEGF、COX-2的濃度。AngII酶聯免疫試劑盒、AT1R酶聯免疫試劑盒和COX-2酶聯免疫試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3 細胞增殖實驗

使用細胞計數試劑盒檢測TPJS對腎癌細胞增殖的影響。ACHN和A498細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，加入培養液100 μL。在吸附24 h后，添加不同濃度的TPJS, 分別持續12、24、48 h。取出培養基，采用100 μL含有CCK-8試劑的培養基在37 ℃下孵育2 h。使用分光光度對細胞進行檢測。

1.4 細胞凋亡檢測

使用異硫氰酸熒光素Annexin V凋亡檢測試劑盒，根據制造商的方案對凋亡細胞進行定量。細胞培養于6孔板上，密度為每孔1×105個細胞。生長24 h后，采用不同濃度的TPJS處理細胞，并采集細胞進行凋亡檢測。未處理的細胞作為陰性對照。

1.5 菌落形成試驗

將細胞按每孔1×103個接種于6孔板上，不同濃度TPJS處理6 h后培養2周。采用4%多聚甲醛固定細胞后，計數形成的菌落數量，并用結晶紫染色液染色。

1.6 Caspase Glo 3/7測定

將細胞按每孔5×103個接種在96孔板上，并暴露于不同濃度的TPJS中。每孔加入等量的Caspase Glo 3/7試劑，室溫避光孵育30 min, 采用發光儀對其進行測量。

1.7 細胞毒性試驗

根據制造商的協議，使用乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒評估TPJS的細胞毒性。細胞置于96孔板中培養, TPJS處理24 h, 400×g離心5 min, 收集培養液。將上清液(每孔120 μL)轉移到另一個96孔板，每孔加入60 μL LDH檢測試劑。室溫避光孵育30 min, 采用分光光度計測量濃度。

1.8 Western Blot分析

檢測凋亡相關蛋白Caspase 9、B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2樣蛋白4(Bax)在腎癌細胞中的表達。采用放射免疫沉淀分析緩沖液裂解細胞，然后在4 ℃提取總蛋白。采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉移到聚偏氟乙烯膜上。室溫下采用5%脫脂牛奶在Tris緩沖鹽水和Tween 20(TBS-T)中封閉細胞膜1 h, 然后采用兔抗人Caspase 9(1∶1 000, 購自英國Abcam公司)和Bcl-2兔單克隆抗體(1∶1 000, 購自英國Abcam公司)。采用兔抗人GAPDH多克隆抗體(1∶2 000, 購自英國Abcam公司)作為內參。采用TBS-T洗滌3次，每次5 min, 采用過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000, 購自英國Abcam公司)孵育1.5 h。最后，在暗室中采用ECL發光溶液(購自Solarbio公司)涂覆膜并置于凝膠成像儀中拍攝。

1.9 統計學分析

采用SPSS 24.0進行統計分析, ELISA、菌落形成和Caspase-Glo 3/7檢測重復3次, CCK-8和細胞毒性試驗共進行4次。采用單因素方差分析和雙側t-test檢驗評估2組數據在所有實驗中的差異。計量數據以均數±標準差表示。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TPJS抑制腎癌細胞的生長

本研究采用CCK-8法測定細胞活力，觀察TPJS對腎癌細胞增殖的影響。與采用0 μmol/L TPJS處理的細胞相比，采用25、50、100、150、200 μmol/L TPJS處理的腎癌ACHN和A498細胞12、24、48 h后，細胞活力受到顯著抑制，并呈劑量和時間依賴性的特點。細胞形態學分析結果顯示，未經處理的腎癌細胞生長良好，而經TPJS處理的細胞形態扭曲、變圓并發生凋亡。TPJS治療6 h后，菌落形成試驗結果顯示，與0 μmol/L TPJS對照相比，竹節參總皂苷治療6 h后菌落形成顯著減少。見圖1。

2.2 TPJS誘導腎癌細胞凋亡

為闡明TPJS對腎癌細胞凋亡的作用，分別測定了細胞毒性、Caspase 3/7活性、細胞凋亡及Caspase 9、Bcl-2和Bax的表達。結果顯示，與0 μmol/L TPJS處理的細胞比較，不同濃度TPJS處理后顯著增強了細胞毒性和Caspase 3/7活性。流式細胞術檢測結果顯示, TPJS治療24 h后可誘導腎癌細胞凋亡。TPJS可以上調Caspase 9和Bax的水平，下調Bcl-2的水平。見圖2。

2.3 TPJS以劑量依賴性方式抑制AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2的表達

采用不同濃度TPJS處理腎癌ACHN和A498細胞24 h后，測定細胞中AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2的水平。與采用0 μmol/L TPJS處理的細胞相比, ACHN和A498細胞系經TPJS治療后的AngⅡ、AT1R、VEGF 和COX-2水平顯著降低，并呈劑量依賴性的特點。見圖3。

2.4 AT1R和VEGF可能逆轉TPJS誘導的腎癌細胞生長抑制和凋亡

為了確定AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2是否可以逆轉TPJS誘導的腎癌細胞生長抑制和凋亡，當細胞暴露于100 μmol/L TPJS時，將其與AngⅡ (2 pg/mL)、AT1R (5 pg/mL)、VEGF (2 pg/mL)和COX-2 (0.5 ng/mL)共孵育。結果顯示, AT1R和VEGF可逆轉TPJS對細胞生長的抑制作用，且細胞凋亡試驗結果與細胞生長結果相似。相反, AngⅡ和COX-2在TPJS誘導的細胞生長抑制和凋亡中未檢測到相關作用。見圖4。

3 討 論

作為一種自由基清除劑和抗氧化劑, TPJS被認為是多種癌癥的有效抗癌化合物，例如肺癌[13]、胃癌[14]、肝癌[15]等。本研究發現TPJS可能以時間和劑量依賴性的方式抑制腎癌細胞的生長，并且還證實了TPJS通過調節凋亡相關蛋白Caspase 3/7/9、Bcl-2和Bax誘導腎癌細胞凋亡，經TPJS處理后AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2水平降低，進一步強調了AT1R和VEGF在TPJS誘導的細胞凋亡中的重要性。

既往認為RAS是一種內分泌系統，其功能僅限于調節血壓和電解質平衡。然而，近期研究[16]表明局部RAS可能參與調節多種生理和病理過程。在RAS系統中, AngⅡ被認為是一種關鍵的生物肽，具有2種主要的特異性受體亞型，包括AT1R和AT2R。作用于AT1R的AngⅡ在調節RAS的大多數作用中具有核心機制[17]。研究[18]表明, RAS通過AngⅡ/AT1R途徑參與生物活性。同時，針對AngⅡ/AT1R途徑的血管緊張素轉化酶抑制劑及血管緊張素受體拮抗劑類藥物治療不僅可以對心血管疾病起作用，還可以改善癌癥患者的生存預后[19]。影響RAS系統AngⅡ及AT1R軸的藥物也可以通過抑制腫瘤微環境和腫瘤異常新生血管的生成，從而減少腫瘤細胞的增殖與轉移[20]。此外, RAS在腎癌腫瘤微環境(TME)中的基質細胞中也會存在表達，例如內皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、T細胞及樹突狀細胞等。這些基質細胞中局部RAS活性是TME免疫抑制的強誘導劑[19]。因此，腎癌中RAS也是治療的關鍵靶點。本研究中, TPJS治療后測定了AngⅡ和AT1R水平，結果表明, AngⅡ和AT1R在細胞中表達下調。VEGF和COX-2是RAS中重要的下游調節因子[21-22], 本研究還發現TPJS處理的細胞中VEGF和COX-2受到抑制，與既往研究[23]結果類似。RAS抑制可能是TPJS誘導腎癌細胞凋亡過程中的重要事件。

RAS已被研究[24-25]證實參與腫瘤的發生和發展。例如, AngⅡ能夠促進肝內膽管癌上皮細胞向間質細胞的轉化[26], 血管緊張素轉換酶抑制劑抑制結直腸癌細胞的生長[27]。AngⅡ通過結合AT1R和細胞外信號調節激酶1/2信號在胰腺癌細胞中誘導VEGF; 此外, AngⅡ/AT1R可能增加VEGF的表達[28]。既往研究[29]顯示, AT1R在腎癌中被確定為上調。研究[30-31]發現，在低氧條件下可檢測到COX-2上調，并通過不同于VEGF軸的機制誘導血管生成。研究[1]報道, TPJS作為一種抗癌藥物，通過RAS依賴途徑發揮作用。本研究探討AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2對TPJS誘導的腎癌細胞生長抑制和凋亡的影響，發現AT1R和VEGF可逆轉TPJS誘導的腎癌細胞生長抑制和凋亡，但AngⅡ和COX-2對TPJS誘導的細胞生長抑制和凋亡無顯著影響，表明AT1R和VEGF是TPJS誘導腎癌細胞增殖抑制和凋亡的關鍵因素。

綜上所述, TPJS可抑制腎癌細胞的生長，誘導細胞凋亡，降低腎癌細胞中AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2的生成，其中AT1R和VEGF可能逆轉TPJS對腎癌細胞的作用。