威寧短柱油茶MKK3基因克隆及生物信息學分析

鄭慶梅， 徐嘉娟， 楊 冰， 霍 達， 朱亞艷， 許 杰， 王 港*

(1.赤水市木司國有林場， 貴州 赤水 564700； 2.貴州省林業科學研究院， 貴州 貴陽 550005)

0 引言

【研究意義】威寧短柱油茶(CamelliasaluenensisStapf.)為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)的常綠灌木或小喬木[1-3]。其株形緊湊，樹姿優美，花色艷麗，可作為園林觀賞樹種；同時，具有耐寒、耐旱、耐瘠薄，抗逆性強，出籽率高，種仁含油率高，油質優等特性，是優良的木本食用油料樹種。因此，威寧短柱油茶具有很高的經濟價值，是支撐貴州省西部高寒山區林業產業發展的優良樹種之一。對其在長期適應高寒山區環境過程中形成的抗逆機制進行研究，有利于用基因工程技術手段改善油茶的抗性和適應性。對威寧短柱油茶MAPKK基因家族成員進行分離克隆，可為進一步研究威寧短柱油茶該基因家族的功能、挖掘威寧短柱油茶抗逆相關基因奠定基礎。【前人研究進展】外界環境脅迫下，植物信號轉導通路主要有絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)級聯途徑、Ca2+依賴信號轉導通路、Ca2+依賴的鹽過敏感信號通路和ABA信號轉導通路4種類型[4-5]。MAPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在真核生物中高度保守[6]。MAPK級聯途徑由絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase, MAPKKK/MEKK)-絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK/MEK/MKK)-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)3種功能上連續作用的蛋白激酶組成[7-9]，MAPKKK位于整個反應的上游，可受Ras、Rho等信號激活，進而通過磷酸化下游的MAPKK將信號傳遞，被激活的MAPKK同樣磷酸化并激活下游的MAPK，從而完成信號的傳遞，調控下游基因的表達，進而參與植物的生長發育、生物脅迫及非生物脅迫響應[6,9-12]。已有研究表明，植物中MAPK在生長發育、非生物脅迫響應、激素信號傳導及防御反應中發揮重要作用。YDA-MKK4/MK5-MPK3/MPK6級聯在RGF1-RGI配體-受體對的下游和PLT1/PLT2的上游發揮作用，調節擬南芥中的干細胞數量和初生根生長[13]；MKK4/MKK5-MPK3/MPK6級聯在調控植物側根形成過程中具有關鍵作用[14]；OsMKK10-OsMKK4-OsMAPK6信號通路正調控水稻的粒徑和重量[15]；ZmMKK4是植物耐鹽耐寒性的正向調節因子[7,16]；擬南芥AtMEKK1-MKK2-MPK4/6級聯通路可提高鹽脅迫耐受性[17]；過表達玉米ZmMKK1基因可提高轉基因煙草對低溫脅迫的抗性[17]。【研究切入點】目前，對威寧短柱油茶的研究主要集中在生物學特性、資源分布、良種選育、栽培技術等方面，對其分子生物學方面的研究尚少，不能充分挖掘其資源優勢。【擬解決的關鍵問題】克隆分離威寧短柱油茶MAPKK基因家族相關基因，獲取MKK3基因全長cDNA序列并進行生物信息學分析，為今后開展該基因功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料于2020年3月采自貴州省畢節市威寧彝族回族苗族自治縣花果山油茶示范基地。選取長勢良好的威寧短柱油茶植株，采集盛花期無病蟲害、發育正常的花蕾，取樣后立即液氮速凍，-80℃冰箱保存備用。

1.2 基因克隆

取威寧短柱油茶花蕾，利用RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取總RNA，通過反轉錄合成cDNA第1鏈(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，-20℃保存備用。根據前期試驗得到的威寧短柱油茶MKK3基因序列，利用Primer 6.0設計特異性引物，正向引物5′TTAGTGGAGCTGTTAAGATGGT3′，反向引物5′ACAAAGGTCCCTTGGATGAG3′，進行PCR擴增，擴增程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環；72℃延伸10 min。回收擴增產物，轉入大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性克隆測序。

1.3 生物信息學分析

利用生物信息學軟件(表1)對獲得的威寧短柱油茶MKK3基因編碼的氨基酸序列、蛋白質基本理化性質、亞細胞定位、二級結構、三級結構、系統進化關系等進行分析。

表1 生物信息學分析軟件

2 結果與分析

2.1 威寧短柱油茶MKK3基因的克隆及序列

以威寧短柱油茶花蕾RNA反轉錄的cDNA為模板，通過RT-PCR擴增獲得威寧短柱油茶MKK3基因cDNA序列全長2 219 bp(圖1)。根據NCBI保守結構域預測(圖2)，該基因編碼的蛋白含有1個MAPKK保守結構域，因此，推測該基因屬于MAPKK基因家族，并在NCBI數據庫進行BLAST比對，發現該基因與茶(Camelliasinensis)、木薯(Manihotesculenta)和橡膠樹(Heveabrasiliensis)的mitogen-activated protein kinase kinase 3(MKK3)基因具有較高的相似性，相似度分別為99.23%、89.00%和88.80%，將其命名為CsMKK3。

2.2 威寧短柱油茶MKK3蛋白的基本理化性質

根據NCBI的ORFfinder預測結果，CsMKK3基因包含1個1 557 bp的開放閱讀框，以ATG為起始密碼子，TAG為終止密碼子，位于398～1 954 bp，編碼518個氨基酸。利用ExPasy Prot Param對編碼的蛋白進行理化性質分析表明，蛋白的相對分子量為57 524.61 Da，理論等電點為5.44，氨基酸組成中亮氨酸(Leu)含量最高，為10%，酸性氨基酸殘基(Asp, Glu)63個，堿性氨基酸殘基(Arg, Lys)48個，親水性平均值為-0.162，不穩定指數42.83，該蛋白為不穩定蛋白。

2.3 威寧短柱油茶MKK3蛋白的親疏水性、跨膜結構及信號肽

由圖3可見，CsMKK3蛋白第71位氨基酸殘基的親水性最強，親水性值為-2.60，第269位氨基酸殘基的疏水性最強，親水性值為2.044。蛋白質親水區域多于疏水區域。因此，推測CsMKK3蛋白為親水性蛋白。對CsMKK3蛋白的跨膜結構及信號肽進行分析表明(圖4～5)，該蛋白不存在跨膜結構，不存在信號肽酶切位點，屬于非分泌型蛋白。

2.4 威寧短柱油茶MKK3蛋白的亞細胞定位及磷酸化位點

對CsMKK3蛋白的亞細胞定位預測發現，該蛋白定位于細胞核。由圖6可見，對CsMKK3蛋白的潛在磷酸化位點進行分析發現，該蛋白存在63個特異性激酶位點，包括28個絲氨酸(S)磷酸化位點、15個蘇氨酸(T)磷酸化位點、10個酪氨酸(Y)磷酸化位點。根據植物蛋白激酶分組，CsMKK3蛋白特異性激酶有AGC組的以cAMP(環腺苷酸)依賴的蛋白激酶PKA、cGMP(環鳥苷酸)依賴的蛋白酶PKG、鈣和磷脂依賴的蛋白激酶PKC及蛋白激酶B(PKB)等14種；屬于CMGG組的p38MAPK、cdc2、GSK3和cdk5等。

2.5 威寧短柱油茶MKK3蛋白的二級結構與三級結構

經SOPMA分析表明(圖7)，α螺旋(Alpha helix)和無規則卷曲(Random coil)是CsMKK3蛋白二級結構的主要成分，均占比38.42%，另外伴有17.37%的延伸鏈(Extended strand)和5.79%的β轉角(Beta turn)。利用SWISS-MODEL在線軟件預測威寧短柱油茶CsMKK3的三級結構(圖8)，該蛋白的主要空間結構由α螺旋和無規則卷曲構成，與二級結構預測結果一致。

2.6 威寧短柱油茶MKK3蛋白的互作關系

對CsMKK3蛋白與相關蛋白的互作網絡預測分析表明(圖9)，CsMKK3蛋白與MAPK蛋白激酶家族的MPK2、MPK14、MPK1、MPK8、MPK5、MPK7、MPK6等蛋白存在相互作用，這些蛋白均為MAPK級聯途徑中被MAPKK激活的下游蛋白激酶。MKK處于MAPK信號傳導途徑中間位置，而其在MAPK相關基因家族中基因數目最少，可以與多個MAPK反應，從而形成多個準確、特定的信號通路。

2.7 威寧短柱油茶MKK3蛋白的系統進化

由圖10可見，威寧短柱油茶CsMKK3和茶MKK3(Camelliasinensis, XP_028069657.1)的遺傳距離最近，聚類為同一小支，而后與洋薊MKK3(Cynaracardunculusvar. Scolymus, XP_024981482.1)和小蓬草MKK3(Erigeroncanadensis, XP_043632042.1)以及河岸葡萄MKK3(Vitisriparia, XP_034707953.1)聚類為一大類。大戟科的3種植物聚為一類，薔薇科的4種植物聚為一類，錦葵科的4種植物和錦葵目木棉科的榴蓮聚為一類，十字花科的擬南芥單獨聚為一類且與其他科植物的距離較遠，說明MKK3基因具有較高的保守性。

3 討論

植物在進化過程及整個生命周期中，特別是對不利條件的抵御，形成了復雜有效的防御機制，并在分子水平、細胞水平和生理水平等方面對各種信號作出響應，從而維持正常的生長和發育[9,18]。MAPK級聯是抗逆途徑的重要信號傳導途徑之一，在植物對各種生物和非生物脅迫響應過程中發揮著重要作用。MEKK1-MKK4/MKK5-MPK3/MPK6級聯在擬南芥免疫信號途徑中發揮重要作用，賦予擬南芥對細菌和真菌病原體的抗性[18]；MAPKKK18-MAPKK3-MAPK1/2/7/13/14參與擬南芥干旱脅迫調控[19]；過表達ZmMKK3的轉基因煙草植株抗氧化能力明顯改善[20]。MAPKK(MKK)位于MAPK級聯系統的中心位置，是接受上游信號刺激并激活下游信號的樞紐，已有研究表明，擬南芥中有10個MKK基因，水稻中有8個MKK基因，玉米中有9個MKK基因[9,11-12,18]。

亞細胞定位預測表明，CsMKK3蛋白定位于細胞核，而茶CsMAPKK3和玉米ZmMKK3均定位于細胞質和細胞核中[21]。研究表明，MAPKK在細胞的各亞細胞區域均有分布，玉米ZmMKK4、擬南芥AtMKK9定位于細胞核中發揮功能，擬南芥AtMKK4在細胞質中發揮作用，油菜(Brassicanapus) BnMKK2、BnMKK3和BnMKK4同時存在于細胞質和細胞核中，擬南芥AtMKK7和AtMKK9在細胞核、細胞質和細胞膜上均有分布[17]。CsMKK3蛋白不存在信號肽和跨膜結構，屬于非分泌蛋白，蛋白質的二級結構主要為α螺旋和無規則卷曲。BLAST比對發現，CsMKK3蛋白與茶MKK3和木薯MKK3蛋白的相似性分別為99.23%和89.00%，結構域分析發現，CsMKK3蛋白包含1個MAPKK保守結構域，推測其屬于MAPKK家族成員。系統進化分析發現，威寧短柱油茶CsMKK3與茶MKK3遺傳距離最近，與洋薊、小蓬草和河岸葡萄聚在一大類，而與其他植物遺傳距離較遠，總體上不同植物MKK3蛋白的聚類與植物系統分類相一致。蛋白互作分析表明，MKK3與MPK2、MPK7及MPK14等相互作用從而參與信號傳導。

磷酸化是植物體內常見的蛋白質翻譯后修飾，蛋白質的磷酸化與去磷酸化過程參與植物溫度脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫、養分脅迫和激素調控等代謝和生理途徑[22]。MAPKKK、MAPKK(MKK)及MAPK組成的MAPK級聯通過逐級的磷酸化完成信號傳遞，對威寧短柱油茶MKK3基因磷酸化位點的預測分析為其功能研究提供參考。

4 結論

研究從威寧短柱油茶花蕾中克隆獲得1個MAPKK基因(CsMKK3)，ORF長1 557 bp，編碼518個氨基酸，蛋白的相對分子量為57 524.61 Da，理論等電點5.44，是無跨膜結構和信號肽的不穩定蛋白，亞細胞定位、磷酸化位點、蛋白互作等預測及系統進化分析均表明其符合MAPKK基因家族特征。對威寧短柱油茶MKK3基因的克隆分離及生物信息學分析，可為進一步研究其功能及深入挖掘威寧短柱油茶抗逆相關基因提供參考。