野生二倍體草莓子葉的再生體系建立

緱一杰， 馮嘉玥， 蘇新雷， 柯 健

(1.楊凌職業技術學院 生物工程分院， 陜西 楊凌 712100； 2.西北農林科技大學 園藝學院， 陜西 楊凌 712100； 3.陜西東籬下現代生態農業有限公司， 陜西 西安 710000； 4.陜西省漢中市略陽縣農業技術推廣中心， 陜西 漢中 724300)

0 引言

【研究意義】草莓(FragariaananassaDuch.)屬多年生草本果樹，薔薇科(Rosaceae)草莓屬，原產于南美洲，目前種植面積廣泛，在中國和歐洲等地均有種植。草莓因其果實含有極高的營養價值而素有“水果皇后”的美稱，已成為植物學研究領域中的重要模式物種。近年來，草莓作為草本果樹逐漸發展為可進行基因功能研究的模式植物，八倍體栽培草莓的高效遺傳轉化體系被廣泛研究，然而其高度雜合的特點使再生周期和遺傳轉化周期較長[1-3]。二倍體草莓基因組較小，是更為理想的模式植物，其高效再生體系是開展草莓基因工程研究的前提[4-7]。因此，以野生二倍體草莓Yellow wonder子葉為材料，研究其子葉高效再生體系，對野生草莓的遺傳轉化研究與應用具有重要意義。【前人研究進展】植物激素濃度配比是影響草莓葉片再生的重要因素，細胞分裂素和生長素分別促進芽的產生和根的形成，2種激素的濃度及配比顯著影響芽和根再生的效果。1988年，柯善強等[8]選擇草莓試管苗的幼嫩葉片，在含有1.5～2.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的MS培養基上培養外植體，可誘導出不定芽，誘導率為20%；1989年，NEHRA等[9]發現，誘導Redcoat草莓葉片再生不定芽的最佳激素配比為6-BA 10 μmol/L+IBA 10 μmol/L。近年來，國內科學家對各類品種草莓的離體再生體系進行了大量研究。張經緯等[10]研究表明，二倍體草莓葉片不定芽分化率和分化速度均低于八倍體草莓。董莉等[11]建立了紅顏草莓葉片的高效再生體系，最終篩選出最佳脫分化培養基為MS+TDZ 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L，最佳分化培養基為MS+TDZ 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L。楊仕品等[12]研究發現，章姬草莓在激素配比為TDA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養基上，葉片再生率可達95.83%。喬瑞琪等[13]研究發現，二倍體草莓Ruegen在激素配比為TDZ 2.0 mg/L+IBA0.2 mg/L培養基上，葉片再生頻率可達81%。【研究切入點】隨著基因工程技術的快速發展，通過轉基因技術加快草莓育種是必然趨勢。而成功的基因轉化必須依賴于高效穩定的再生系統[14]。外植體的選擇是草莓再生技術的關鍵，由于葉片來源廣泛、易于處理，草莓葉片已成為離體再生的最佳材料[15]，但利用草莓子葉作為再生材料的研究鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】以野生草莓Yellow Wonder的子葉為材料建立高效再生體系，為豐富草莓再生材料來源及為草莓育種研究和其他生物技術研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 二倍體野生草莓Yellow Wonder種子采摘于西北農林科技大學。

1.1.2 主要試劑 2%次氯酸鈉、75%酒精、IBA、6-BA、瓊脂和蔗糖均為市購。

1.1.3 培養基及培養條件 種子萌發培養基為1/2 MS+3%蔗糖(液體培養基，pH 5.8)；子葉再生培養基9種(表1)；不定芽繼代培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L；生根培養基分別為MS+IBA 0.1 mg/L和MS+IBA 0.2 mg/L。所有培養基蔗糖和瓊脂均分別為30 g/L和8 g/L，pH 5.8，光照強度3 000～5 000 Lx、光周期16 h /8 h、溫度(25±2)℃。

表1 草莓子葉再生培養基的激素配比

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體制備 將草莓種子在堿性洗衣粉水中浸泡15 min，沖洗干凈后于無菌水中浸泡過夜，用旋渦振蕩儀破除種皮，無菌濾紙吸干種子表面水分，75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗2～3次，在超凈工作臺上用2%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗2～3次，清洗時劇烈搖晃。在無菌條件下，用不加瓊脂的液體萌發培養基將無菌濾紙浸濕，種子接種于濾紙上， 4℃暗培養2周后轉移到組培間[光照強度3 000～5 000 Lx，光周期16 h /8 h，溫度(25±2)℃]進行萌發培養，計算發芽率。

發芽率=(發芽種子數/種子總數)×100%

1.2.2 不同激素配比下子葉誘導不定芽試驗 子葉充分展開后，用手術刀和鑷子取子葉前端部分(1～2 mm)，正面朝上接種于不同激素配比的9種子葉再生培養基中培養。暗培養7 d后轉入長日照環境中培養40 d，統計外植體的脫分化數量和再分化數量，計算出愈率和分化率。每個處理3次重復。

出愈率=(產生愈傷子葉數/接種子葉總數)×100%

分化率=(產生再生芽子葉數/接種子葉總數)×100%

1.2.3 不同暗培養時間下子葉誘導不定芽試驗 培養基為子葉誘導不定芽試驗的最佳分化培養基，暗培養時間設置為0 d(CK)、3 d、7 d和14 d，子葉暗培養結束后改為光暗交替培養40 d。統計外植體的脫分化和再分化數量，計算出愈率和分化率。每個處理3次重復。

1.2.4 不同IBA濃度下不定根誘導試驗 將不定芽轉接到繼代培養基上持續生長，待芽莖伸長至1～2 cm時，將其自基部切下轉接至生根培養基上，比較IBA濃度分別為0.1 mg/L和0.2 mg/L不定根的生長情況，14 d后統計平均根數，計算生根率。每個處理3次重復。

生根率=(長出不定根再生芽數/總芽數)×100%

1.2.5 不同子葉部位誘導不定芽比較試驗 用鑷子和解剖刀切取子葉前端、子葉中部和帶柄子葉3個部位，分別接種于子葉誘導不定芽試驗的最佳分化培養基上培養40 d，篩選出最適宜誘導不定芽的子葉部位。每個處理3次重復。

1.2.6 煉苗與移栽 選擇健壯、根系發達的再生苗20株，噴少量純水，打開瓶蓋在室外煉苗。3日后洗去根部的培養基假植于裝有基質的營養缽中，覆蓋透明塑料蓋保濕，14 d后統計移栽存活率。揭開塑料蓋繼續培養20 d移栽至大田。

1.3 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2007和IBM SPSS Statistics Version 19進行數據統計與分析。

2 結果與分析

2.1 草莓種子的萌發情況

草莓種子進行無菌萌發培養，種子經2周黑暗4℃處理后，在組培間培養第4天開始發芽(圖1 a、b)，出芽率為20%，第10天時發芽率達90%(圖1 c)。

2.2 不同濃度激素草莓子葉不定芽的再生效果

從表2看出，培養Yellow Wonder子葉不定芽再生效果最好的激素配比是處理6(6-BA 3.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L)，出愈率為93.33%，分化率為83.33%，明顯高于其他激素處理組合；當6-BA濃度增高到4.4 mg/L時，不定芽分化率呈明顯下降趨勢，且有明顯玻璃化現象的產生，長勢變弱。

表2 不同激素配比下草莓子葉不定芽的再生效果

2.3 不同暗培養時間草莓子葉不定芽的再生效果

從表3看出，經不同暗培養時間后，暗培養7 d的出愈率和分化率均最高，分別達90.74%和85.93%，均顯著高于CK；暗培養14 d時子葉邊緣和傷口處有輕微褐化現象。表明，誘導Yellow Wonder草莓子葉不定芽的暗處理最佳時間為7 d。

表3 不同暗培養時間下子葉不定芽的再生效果

2.4 IBA不同濃度誘導草莓不定根的效果

從表4看出，較高濃度IBA對草莓不定根的誘導較好，IBA濃度為 0.2 mg /L時，生根率可達100%，平均根數11.8條。

表4 IBA不同濃度誘導草莓不定根的效果

2.5 草莓子葉不同部位不定芽的再生效果

從表5看出，草莓子葉前端、子葉中部、帶柄子葉3個部位接種于6-BA 3.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L的再生培養基上誘導40 d后，不定芽出愈率最高的是子葉中部，為94%；其次是帶柄子葉，為90%；子葉前端最低，為85%。接種3個部位不定芽的分化率也以子葉中部最高，為85%；其次是帶柄子葉，為79%；子葉前端最低，為60%。表明，最適宜誘導草莓子葉不定芽的部位為子葉中部，其次是帶柄子葉。

表5 草莓子葉不同部位不定芽的再生效果

2.6 再生苗移栽成活率

20株再生苗經煉苗、假植、移栽后存活率達100%，均可正常開花結果，無病害發生。

3 討論

在自然條件下，草莓種子很難正常發芽[10]，需對種子進行特殊處理才會提高發芽率[16-17]。研究通過消毒前對種子進行過夜浸泡，用旋渦振蕩儀破除種皮，并在消毒完成后對種子進行2周低溫春化處理，種子發芽率達90%。除基因調控外，激素的種類和濃度是影響草莓葉片再生的主要因素。細胞分裂素利于不定芽的形成，生長素可促進生根，將二者進行不同濃度搭配后可調節不定芽的形成[18]。NYMAN等[19]研究得出，Redcoat草莓葉片再生的最佳激素配比為6-BA 10 μmol/L+IBA 10 μmol/L；周鶴瑩等[20]研究表明，二倍體草莓Hawaii4在6-BA 3.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L的培養基上再生頻率達80%。研究結果表明，Yellow Wonder草莓子葉在6-BA 3.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L的再生培養基上培養，不定芽出愈率為93.33%，分化率為83.33%，適合用于遺傳轉化研究。

暗培養時間是影響草莓葉片再生的重要因素[13]，暗培養有利于加快愈傷組織的形成并減少酚類物質的產生，減輕褐變[7]。不同品種和基因型草莓適合的暗培養時間有所不同，二倍體草莓Hawaii4的暗培養時間是3 d[20]，豐香草莓是28 d[21]，紅顏草莓是10 d[8]；試驗中Yellow Wonder草莓暗培養的最佳時間為7 d，出愈率和分化率均最高，分別達90.74%和85.93%。不同子葉部位的再生能力有所不同，如辣椒子葉再生培養中，以較嫩的子葉和子葉中部容易誘導愈傷組織和植株再生[22]，這與本研究草莓子葉最適宜部位為子葉中部的結論相一致。

4 結論

研究建立了野生草莓Yellow Wonder子葉的高效再生體系，即將Yellow Wonder草莓種子在萌發培養基(1/2 MS+3%蔗糖)中培養至發芽；將子葉中部切下，正面朝上置于子葉再生培養基(6-BA 3.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L)上；在室溫條件下暗處理7 d后，轉入(25±2)℃長日照條件下培養40 d誘導出不定芽；不定芽轉接到繼代培養基(MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L)上持續生長，待芽苗伸長至1～2 cm后，再轉接到生根培養基(MS+IBA 0.2 mg/L)中進行生根培養。再生苗經煉苗、假植、移栽后，存活率達100%，且可正常開花結果，無病害發生。