基于質量標志物的白芍配方顆粒量值傳遞規律及工藝優化研究

孫葉芬，岳倩俠，杜倩倩，楊 爽，金傳山，張 偉,3，程世云，李翔宇，陳 慶

(1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012;2.中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012;3.省部共建安徽道地中藥材品質提升協同創新中心，安徽 合肥 230012; 4.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051; 5.安徽濟人藥業股份有限公司，安徽 亳州 236800;6.安徽宏方藥業有限公司，安徽 亳州 236800)

白芍配方顆粒以白芍飲片為原料，經提取、濃縮、干燥、制粒等工藝制成的具有一定規格的供臨床直接使用的顆粒[1]。根據白芍配方顆粒國家標準[2]，課題組前期對企業生產的3批白芍配方顆粒進行檢測，結果出膏率、浸出物含量、芍藥苷含量、特征圖譜等指標均符合國家標準要求。但由于白芍成分復雜，僅通過芍藥苷來研究白芍配方顆粒生產過程中量值傳遞，難以準確表征生產過程中整體質量變化。

中藥質量標志物是與中藥的功能屬性密切相關，可進行定性、定量的化學物質，可以作為反映中藥安全性和有效性的標志性物質進行質量控制，體現中藥組方配伍的整體性、多元性的質量控制概念，可為中藥質量控制指標的合理選擇提供研究途徑[3-8]。本課題組前期結合質量標志物的基本原則，確定白芍質量標志物為沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷共6個成分。

因此，本研究在符合白芍配方顆粒國家標準的制備工藝基礎上，通過研究白芍質量標志物中6個成分在提取、濃縮、干燥、制粒等生產環節的量值傳遞情況，尋找其關鍵影響因素，優化制備工藝，提升白芍配方顆粒整體質量。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑 Thermo Fisher UltiMate3000高效液相色譜儀(LPG-3400SDN四元泵，DAD-3000檢測器)：賽默飛世爾科技有限公司；旋轉蒸發儀(YRE-201D)：鞏義市予華儀器有限責任公司；百萬分之一微量分析天平(EX-H3052)：上海贊維衡器有限公司；超聲波清洗器(JK-300DB)：合肥金尼克機械制造有限公司；噴霧干燥器(ADL311-A)：浚和儀器科技有限公司。

1.2 藥材與試劑 3批白芍飲片(批號分別為P21032601、P21031301、P21031302)：安徽濟人藥業有限公司；沒食子酸(批號 110831-201906，純度 91.5%)、芍藥苷(批號：110736-202145，純度98.00%):中國食品藥品檢定研究院；氧化芍藥苷(批號 21092304，純度 99.42%)、芍藥內酯苷(批號 21031706，純度 98.75%)、沒食子酰芍藥苷(批號 DST190723-064，純度 98.00%)、苯甲酰芍藥苷(批號 21091008，純度 98.40%)：成都普菲德生物技術有限公司；甲醇(色譜醇，批號 A22T0105)、乙腈(色譜醇，批號 A22T0218)：美國阿斯頓化學技術有限公司；磷酸(分析純，批號 2021110801)：成都市科隆化學品有限公司。

2 方法與結果

2.1 白芍配方顆粒原制備工藝

2.1.1 提取工藝 白芍飲片加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮提取1.5 h，過300目篩，藥渣再加8倍水，煎煮1.0 h，過300目篩，合并2次濾液。

2.1.2 濃縮工藝 將濾液加入減壓濃縮系統中，于真空度-0.08 MPa，70 ℃下濃縮至相對密度為1. 07～1.09 g/mL的濃縮液。

2.1.3 干燥工藝 將濃縮液持續攪拌，以進風溫度170～180 ℃、出風溫度60～90 ℃、送料泵25～50 r/min進行噴霧干燥，得干膏粉。

2.1.4 制粒工藝 干膏粉中加適量糊精，混合均勻，干法制粒，軋輪轉速 8 r/min，壓力7 MPa，水平送料速度30 r/min，粉碎，過篩，即得。

2.2 含量測定方法

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取對照品沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷和苯甲酰芍藥苷適量，分別置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇溶解并定容至刻度，得質量濃度分別為沒食子酸70.42 μg/mL、氧化芍藥苷199.60 μg/mL、芍藥內酯苷40.08 μg/mL、芍藥苷21.12 μg/mL、沒食子酰芍藥苷100.00 μg/mL和苯甲酰芍藥苷102.80 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

(1)白芍飲片供試品溶液制備 白芍粉末約0.5 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加稀乙醇定容至刻度，超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

(2)提取液、濃縮液、干膏粉、配方顆粒供試品溶液制備 精密量取提取液2.0 mL、濃縮液1.0 mL，精密稱取干膏粉、配方顆粒各0.1 g，分別置于25 mL容量瓶中，加入稀乙醇定容至刻度，超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 Aglient ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min，5% A→9% A；5～8 min, 9% A→15% A；8～23 min，15% A→25% A；23～28 min，25% A→35% A；28～35 min，35% A→90% A)；流速1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，檢測波長為257 nm(1～14 min)、230 nm(14～35 min)。見圖1。

注：1.沒食子酸；2.氧化芍藥苷；3.芍藥內酯苷；4.芍藥苷；5.沒食子酰芍藥苷；6.苯甲酰芍藥苷

2.2.4 方法學考察

(1)線性關系考察 精密稱取6種對照品適量，置于5 mL量瓶中，用70%甲醇溶解并定容。精密量取對照品溶液，分別稀釋至對應濃度，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制各組分標準曲線，計算回歸方程和相關系數。結果表明，6種成分在如下范圍內成良好的線性關系。見表1。

表1 線性關系考察結果

(2)精密度試驗 取供試品溶液，連續進樣6次，分別計算各組分色譜峰峰面積RSD值，結果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.06%、0.16%、0.17%、0.09%、0.26%、0.07%，表明該儀器精密度良好。

(3)重復性試驗 取供試品溶液，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，進樣。沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷質量分數的RSD值分別為1.95%、2.75%、2.45%、1.93%、2.62%、1.70%，表明該方法重復性良好。

(4)穩定性試驗 取供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h進樣。沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.86%、1.84%、2.15%、0.39%、0.89%、0.99%，供試品溶液在24 h內穩定性良好。

(5)加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的白芍飲片6份，每份0.25 g，按1∶1分別加入沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷對照品適量，進樣，并計算回收率。平均加樣回收率分別為92.57%、99.58%、98.40%、105.56%、94.58%、92.63%，RSD值分別為0.96%、2.37%、0.79%、0.43%、1.79%、1.19%。結果表明該方法準確可靠。

2.3 白芍配方顆粒原制備工藝中白芍質量標志物6種成分含量測定及量值傳遞分析 精密吸取3批各供試品溶液10 μL，按“2.2.3”項下方法進樣，測定供試品溶液中6種成分含量，計算轉移率。含量和轉移率計算公式：w(飲片)/%=[ρ(指標成分)/(mg/mL)]×[V(稀釋液)/mL]/[m(稱樣量)/g]/1 000×100；w(提取液或濃縮液)/%=[ρ(指標成分)/(mg/mL)]×n(稀釋倍數)×[V(總樣品)/mL]/[m(總飲片)/g]/1 000×100；w(干膏粉或顆粒)/%=[ρ(指標成分)/(mg/mL)]×[V(稀釋液)/mL]/[m(稱樣量)/g]×[m(總樣品)/g]/[m(總飲片)/g]/1 000×100。r(轉移率)/%=w(樣品中指標成分)/w(飲片中指標成分)×100。并采用SPSS 23.0軟件對飲片-提取液、提取液-濃縮液、濃縮液-干膏粉、干膏粉-配方顆粒中6種成分含量和轉移率進行獨立樣本t檢驗。見表2、表3。

表2 白芍配方顆粒制備過程中6種質量標志物的含量

表3 白芍配方顆粒制備過程中6種質量標志物的轉移率

結果顯示，提取過程中，氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的含量分別下降44.00%、24.56%、27.28%、19.57%、37.25%，其中氧化芍藥苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的含量顯著降低(P<0.05)；干燥過程中，6種成分含量均有降低趨勢，且芍藥內酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的轉移率分別降低10.78%、11.29%、15.62%、11.38%，差異均有統計學意義(P<0.05)；在提取-濃縮和干燥-制粒兩個過程中，6種成分含量無顯著下降(P>0.05)，且轉移率相對較高。

從各過程中6種成分含量和轉移率的變化來看，提取過程和干燥過程為關鍵生產環節，根據原制備工藝參數，經研究表明，6種成分含量均隨著溫度的升高而降低，隨著時間的延長呈現先增加后趨于平緩而后下降的趨勢。因此，提取時間和干燥溫度為關鍵影響因素，可進一步優化。

2.4 白芍配方顆粒制備工藝優化

2.4.1 出膏率的測定 精密量取提取液25 mL，分別置于已干燥至恒質量的蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算出膏率。

2.4.2 熵權法確定權重 按文獻[9-13]的方法計算權重。

(1)數據標準化處理 假設m個評價對象n個評價指標的原始數據矩陣為X=(Xij)mn，進行標準化處理后的數據矩陣Y=(Yij)mn。對于正向指標，采用下列公式進行標準化處理。Xij=(aij-minj{aij})/(maxj{aij}-minj{aij})，Xij表示第i次試驗時第j個評價指標的取值，i=1，2，3，…，m；j=1，2，3，…，n。

(3)計算各指標信息熵(Hj)

(4)計算各指標的權重系數(Wj)

2.4.3 工藝關鍵參數優化

(1)第1次提取時間考察 稱取4份白芍飲片(100 g)，加入10倍量水，浸泡30 min，分別煎煮40、60、80、100 min后，300目篩濾過，濾渣加8倍量水，煎煮40 min，300目篩濾過，合并濾液，得提取液。測定6種成分含量和出膏率，計算各指標權重系數和綜合評分。根據綜合評分確定40 min為最佳提取時間。見表4、表5。

表4 第1次提取時間考察時各指標熵值及權重系數(n=3)

表5 第1次提取的樣品考察結果(n=3)

(2)第2次提取時間考察 稱取3份白芍飲片(100 g)，加入10倍量水，浸泡30 min，煎煮40 min，300目篩濾過，濾渣加8倍量水煎煮，分別煎煮30、40、50 min，300目篩濾過，合并濾液，得提取液。測定6種成分含量和出膏率，計算各指標權重系數和綜合評分。根據綜合評分確定40 min為最佳提取時間。見表6、表7。

表6 第2次提取時間考察時各指標熵值及權重系數(n=3)

表7 第2次提取的樣品考察結果(n=3)

(3)干燥溫度考察 將4份濃縮液過濾后，分別按照140、150、160、170 ℃進行噴霧干燥，即得干膏粉。測定6種成分含量和出膏率，計算各指標權重系數和綜合評分。根據綜合評分確定最佳干燥溫度為140 ℃。見表8、表9。

表8 干燥溫度考察時各指標熵值及權重系數

表9 不同干燥溫度下樣品考察結果(n=3)

結果表明，白芍配方顆粒最佳工藝：100 g白芍飲片加10倍量水浸泡30 min，煎煮40 min，濾過，加8倍量水煎煮40 min，濾過，合并濾液；以70 ℃進行減壓濃縮，濃縮至相對密度為1.07～1.09 g/mL，濾過；以進風溫度140 ℃進行噴霧干燥，得干膏粉；加入適量糊精，進行干法制粒。

2.4.4 驗證實驗 取3批白芍飲片按最佳工藝進行驗證實驗，結果表明，提取液、干膏粉中6種成分含量和轉移率的RSD值均小于4.0%，表明工藝重復性好、穩定、可行。見表10、表11。

表10 驗證實驗所得6種成分的含量及出膏率(n=3)

表11 驗證實驗所得6種成分的轉移率(n=3)

2.5 優化前后6種質量標志物的轉移率比較 將優化前后提取液、干膏粉的轉移率導入SPSS 23.0軟件中進行獨立樣本t檢驗，結果發現6種成分的轉移率在優化后的提取液、干膏粉中均有不同程度的增加，其中芍藥內酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷轉移率在提取液中分別增加16.81%、9.51%、12.96%、7.67%，差異均有統計學意義(P<0.05)；在干膏粉中分別增加15.67%、11.81%、11.63%、11.20%，差異均有統計學意義(P<0.05)，表明優化后白芍配方顆粒質量明顯提升。見圖2、圖3。

注：A.沒食子酸；B.氧化芍藥苷；C.芍藥內酯苷；D.芍藥苷；E.沒食子酰芍藥苷；F.苯甲酰芍藥苷；與優化前比較，*P<0.05

注：A.沒食子酸；B.氧化芍藥苷；C.芍藥內酯苷；D.芍藥苷；E.沒食子酰芍藥苷；F.苯甲酰芍藥苷；與優化前比較，*P<0.05

3 討論

本實驗在符合白芍配方顆粒國家標準工藝的基礎上，通過6種白芍質量標志物成分(沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷)的含量和轉移率分析白芍配方顆粒生產過程中的量值傳遞規律，發現在濃縮和干燥兩個過程中6種成分能夠較好傳遞，轉移率較高，而在提取過程和干燥過程中，除了沒食子酸外的5種成分轉移率相對較低，傳遞較差。結合實驗室研究，確定提取時間和干燥溫度為生產過程中的關鍵影響因素。

實驗以出膏率和質量標志物成分的含量為指標，通過熵權法確定權重，計算綜合評分，優選提取時間和干燥溫度參數。結果確定最佳參數為“兩次提取時間均為40 min，以140 ℃進行噴霧干燥”。與原工藝相比，優化后工藝的6種成分的轉移率均有增加，其中芍藥內酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等成分轉移率的增加具有統計學意義，表明白芍質量標志物在一定程度上得到了保留，白芍配方顆粒的質量得到提升。

本研究基于質量標志物研究白芍配方顆粒生產過程中的質量傳遞規律，較詳盡地反映生產過程中質量的變化和關鍵影響因素，并通過對關鍵影響因素進行工藝優化，提高了質量標志物成分的轉移率，為白芍配方顆粒的生產和質量控制提供了科學依據。