華蟾素注射液抑制小鼠黑色素瘤的作用及機制研究

劉霞霞，陳 馨，王文君，程 卉，吳 歡

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.教育部新安醫學重點實驗室，安徽 合肥 230038；3.安徽中醫藥大學科研技術中心，安徽 合肥 230038)

黑色素瘤是一種具有強侵襲性的皮膚腫瘤。其發病率雖低，但惡性程度高、轉移發生早、致死率高，占所有皮膚癌相關死亡病例的80%以上[1]。近年來，黑色素瘤患者不斷增加，據估計2020年黑色素瘤新增癌癥病例超過10萬例[2]。在早期，手術切除腫瘤可獲得良好的預后，然而，由于黑色素瘤的強侵襲性和轉移能力，手術很少能延長晚期患者的生存時間。轉移是導致黑色素瘤晚期患者死亡的主要原因之一。目前，針對黑色素瘤高侵襲性特點的藥物有限，且臨床上治療癌癥的有效化學治療藥物具有嚴重的毒性和不良反應。因此，尋找毒性和不良反應小且能有效抑制黑色素瘤生長和轉移的藥物迫在眉睫。

上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal trans-formation，EMT)指上皮細胞通過一定的程序轉化成間質細胞，這一過程使細胞具有轉移和侵襲的能力。黑色素瘤的轉移侵襲能力與EMT密切相關。EMT首先涉及細胞骨架的重組，使腫瘤發生侵襲和轉移成為可能[3]。越來越多的證據表明，在EMT期間，與細胞骨架相互作用的蛋白，如上皮鈣黏蛋白(epithelial cadherin,E-cadherin)下調，而間充質標志物，如Vimentin和神經鈣黏蛋白(nervous cadherin,N-cadherin)表達上調[4]。此外，在EMT的最后階段，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)等蛋白酶的表達使基膜和細胞外基質(extracellular matrix,ECM)降解增加[5]。EMT過程中黑色素瘤細胞的黏附性減弱，形態更像間充質細胞，有利于癌細胞的侵襲，向體內不同微環境遷移，形成轉移。

華蟾素是中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍干燥表皮的水煎煮提取物，具有清熱解毒、消腫止痛的功效。華蟾素注射液是華蟾素在臨床上使用較為廣泛的一種制劑，其多種有效成分在體內可發揮作用[6]。研究[7-10]表明，華蟾素注射液對胃癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌等惡性腫瘤有較好的抑制作用。華蟾素可通過抑制腫瘤細胞增殖、阻滯細胞周期、抗腫瘤血管生成、調控免疫應答等多種途徑發揮抗腫瘤作用[11-12]，但華蟾素對黑色素瘤的作用及其機制尚未明確。因此，本研究以黑色素瘤移植瘤小鼠為研究對象，初步探討華蟾素注射液對黑色素瘤移植瘤小鼠的作用及其機制，為華蟾素注射液應用于臨床治療黑色素瘤提供一定的實驗依據。

1 試劑與材料

1.1 細胞株 黑色素瘤細胞B16F10購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥品與試劑 華蟾素注射液(批號 191204-2)：安徽華潤金蟾藥業有限公司；RPMI-1640培養基(GP21040160382)、抗Vimentin抗體(GB12192)：武漢賽維爾生物科技有限公司；胎牛血清(2177370)：美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液(批號 080421211018)：江蘇碧云天生物技術有限公司；抗Ki67抗體(ab15580)：Abcam；抗MMP-2抗體(bs-4599R)、抗MMP-9抗體(bs-0397R)：Bioss； 抗E-cadherin抗體(14472)、N-cadherin抗體(Cell Signaling Technology,14215)：美國CST公司。

1.3 實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠，雄性，體質量18～22 g，購于杭州子源實驗動物中心[生產許可證號：SCXK(浙)2019-0004]。小鼠經預適應1周后進行后續實驗，實驗室濕度為(55±10)%，溫度為(20±0.5)℃，明暗周期為12 h/12 h。研究方案經安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(動物倫理編號：AHUCM-mouse-2021062)。

1.4 儀器 CO2培養箱：美墨爾特貿易有限公司；-80 ℃冰箱：日本Sanyo公司；Olympus CKX41型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；BSC-1000Ⅱ A2型生物安全柜：浙江蘇凈凈化設備有限公司；滅菌鍋：日本Hirayama公司；ZT-12M型自動脫水機：孝感市亞光醫用電子科技有限公司；YB-7B型石蠟包埋機：孝感市亞光醫用電子技術有限公司；科力飛切片漂烘儀：安徽電子科學研究所；RM2135型Leica切片機：德國徠卡儀器有限公司；HIETECH數字切片掃描儀：濟南丹吉爾電子有限公司；165-8001 Mini-Protean Tetra型電泳儀、電泳槽：美國Bio-Rad公司；Gel View 6000 Plus凝膠成像系統：廣州博鷺騰生物技術有限公司。

2 方法

2.1 黑色素瘤移植瘤模型的復制 取生長狀態良好的B16F10細胞，調整細胞密度為2×107/mL，每只C57BL/6小鼠右側腋下接種100 μL細胞懸液。

2.2 動物分組及給藥 模型復制后小鼠腋下注射細胞部位出現米粒大小的包塊表明模型復制成功，將模型復制成功后的小鼠隨機分成對照組，華蟾素注射液低、中、高劑量組，每組10只。華蟾素注射液低、中、高劑量組小鼠分別被腹腔注射156、312、468 mg/mL華蟾素注射液，注射容積均為0.15 mL，連續15 d；對照組小鼠被腹腔注射0.15 mL生理鹽水。實驗過程中，隔日稱量小鼠體質量1次，第16天用10%烏拉坦麻醉小鼠后，頸椎脫臼法處死小鼠，解剖剝離瘤體并稱質量。

2.3 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察移植瘤的組織形態 取出各組固定在4%多聚甲醛磷酸緩沖液的黑色素瘤體，先用濃度梯度遞增的乙醇進行脫水，然后用二甲苯進行透明，最后利用石蠟對瘤體包埋后做切片，片厚為4 μm，對移植瘤組織進行HE染色。光學顯微鏡下觀察黑色素瘤移植瘤的組織形態。

2.4 免疫組織化學法檢測Ki-67、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9表達水平 將取出的各組黑色素瘤體的石蠟切片進行脫蠟和水化處理后，再用抗原修復，之后加入3%過氧化氫溶液除去內源性過氧化氫酶，再滴加3% BSA進行封閉，取出，置于相應的一抗中，于4 ℃環境下孵育過夜。二抗室溫孵育50 min后，加入DAB顯色，最后用蘇木精復染后進行脫水封片。 采用Image J軟件測定免疫組織化學染色照片的平均光密度值，計算陽性蛋白的相對表達水平。

2.5 Western blot法檢測蛋白表達水平 將凍存在-80 ℃冰箱中的黑色素瘤組織取出，放置在冰上，取出一小部分組織，置于研磨器中，加入含有磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，充分研磨裂解，超聲破碎，-4 ℃離心(12 000 r/min)20 min，收集上清液。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，用裂解液將蛋白濃度稀釋配平至20 μg/mL，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮沸。用10%聚丙烯酰胺凝膠將蛋白電泳分離，冰浴，濕轉，將蛋白轉至NC膜，用體積分數為5%的脫脂牛奶室溫封閉，TBST洗膜3次，將不同蛋白區域剪開，分別加入一抗稀釋液的Vimentin(稀釋度1∶1 000)、N-cadherin(稀釋度1∶1 000)、MMP-9(稀釋度1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，用相應二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后用化學發光液進行條帶曝光。采用Image J軟件測定條帶的灰度值，計算蛋白的相對表達水平，以β-actin為內參。

3 結果

3.1 4組小鼠黑色素瘤移植瘤質量比較 與對照組比較，華蟾素注射液低、中、高劑量組小鼠黑色素瘤移植瘤質量均顯著降低(P<0.05)，華蟾素注射液高劑量組小鼠移植瘤質量最低。見圖1。

注：A.對照組；B.華蟾素注射液低劑量組；C.華蟾素注射液中劑量組；D.華蟾素注射液高劑量組；與對照組比較，*P<0.05

3.2 不同時點4組小鼠體質量比較 小鼠腋下移植黑色素瘤細胞B16F10后第11天開始，對照組小鼠體質量逐漸降低，至移植術后第15天，對照組小鼠體質量顯著低于華蟾素注射液低、中、高劑量組；各時點華蟾素注射液高劑量組小鼠體質量高于華蟾素注射液中、低劑量組，但差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05

3.3 華蟾素注射液對黑色素瘤移植瘤組織形態的影響 對照組小鼠移植瘤細胞具有明顯的黑色素瘤的組織形態特征，胞漿邊界清楚、呈玻璃樣，細胞核偏置，核仁突出，黑色素瘤細胞可以是多形性的，呈上皮樣、成角、小而圓；病變中黑色素細胞真皮處可形成巢，細胞密度增加。而華蟾素注射液低、中、高劑量組小鼠移植瘤中黑色素細胞形成的巢較少見，細胞密度降低，細胞體積較對照組增大，細胞核深染現象得到緩解。見圖3。

注：A.對照組；B.華蟾素注射液低劑量組；C.華蟾素注射液中劑量組；D.華蟾素注射液高劑量組

3.4 4組小鼠移植瘤組織中Ki-67蛋白表達水平比較 免疫組織化學染色結果顯示，黑色素瘤細胞的細胞核若無染色或淡黃色則表示Ki-67蛋白低表達，若染色為黃褐色或棕色則表示Ki-67蛋白高表達。與對照組比較，華蟾素注射液中、高劑量組小鼠黑色素瘤移植瘤中Ki-67蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖4、圖5。

注：A.對照組；B.華蟾素注射液低劑量組；C.華蟾素注射液中劑量組；D.華蟾素注射液高劑量組

注：A.對照組；B.華蟾素注射液低劑量組；C.華蟾素注射液中劑量組；D.華蟾素注射液高劑量組；與對照組比較，*P<0.05

3.5 4組小鼠移植瘤組織遷移相關蛋白表達水平比較 免疫組織化學染色結果顯示，棕褐色越深表明蛋白表達水平越高。與對照組比較，華蟾素注射液中、高劑量組E-cadherin蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)，華蟾素注射液低、中、高劑量組N-cad-herin、MMP-9蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；華蟾素注射液中、高劑量組MMP-2、Vimentin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖6、圖7。Western blot檢測結果顯示，華蟾素注射液低、中、高劑量組移植瘤中N-cadherin、Vimentin、MMP-9蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖8、圖9。

圖6 4組小鼠移植瘤中N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白的免疫組織化學染色結果(10×20倍)

圖7 4組小鼠移植瘤中N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平比較

注：A.對照組；B.華蟾素注射液低劑量組；C.華蟾素注射液中劑量組；D.華蟾素注射液高劑量組

注：與對照組比較，*P<0.05

4 討論

黑色素瘤是一種轉移能力極強、病死率極高的皮膚惡性腫瘤，嚴重危害人類健康。轉移是惡性腫瘤較為顯著的特征之一，腫瘤細胞一方面可以在原發部位生長，另一方面能夠通過多種途徑蔓延、擴散、定植到其他部位。在黑色素瘤的特征中，高侵襲性是阻礙黑色素瘤治療的關鍵。因此，抑制腫瘤的轉移和增殖能力是治療腫瘤的基本途徑之一。

EMT在許多癌癥生物學行為中起著至關重要的作用，如腫瘤的遷移和侵襲，抑制EMT的發生能夠抑制腫瘤的侵襲和轉移[13]。有關侵襲性MMPs的研究表明，MMPs在腫瘤轉移中具有重要的作用，其中MMP-2和MMP-9與惡性腫瘤的遠處播散密切相關。MMPs通過分解基底膜蛋白，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，被認為是癌癥細胞侵襲的重要促進因子。黑色素瘤細胞在轉移之前通常會經歷EMT，這使得腫瘤細胞更容易發生遷移和侵襲。Vimentin是中間纖維蛋白最主要的組成成分，與微管、微絲共同構成細胞骨架，參與調控細胞黏附、細胞形狀變化和遷移速度。N-cadherin是一種黏附分子，主要介導細胞與細胞間的動態黏附。N-cadherin表達上調可增強多種上皮癌細胞在體外的遷移和侵襲能力。EMT的發生伴隨著一系列變化，細胞會抑制一些上皮細胞黏附分子，如E-cadherin的表達水平降低，而增加間充質細胞黏附分子如Vimentin的表達水平，獲得遷移和侵襲能力[14]。黑色素瘤細胞的增殖能力也影響著腫瘤的治療。Ki-67蛋白是一種半衰期短的非組蛋白核蛋白，是臨床上檢測腫瘤細胞增殖活性的常見指標。此外，邢芳林等[15]研究認為，Ki-67蛋白的表達水平能夠反映患者惡性腫瘤增殖率，其高表達與患者的不良預后密切相關，能一定程度上反映腫瘤進展[16]。

本研究發現，華蟾素注射液可以緩解黑色素瘤移植瘤對小鼠造成的功能損傷，可抑制黑色素瘤移植瘤質量的增加，光學顯微鏡下發現華蟾素注射液組移植瘤的組織形態特征發生明顯變化，結果說明華蟾素注射液可以抑制移植瘤的生長。通過對移植瘤組織Ki-67蛋白表達情況的研究，發現華蟾素注射液可抑制黑色素瘤細胞的增殖能力，但其是否與抑制黑色素瘤的高侵襲性有關還有待進一步研究。免疫組織化學和Western blot實驗結果顯示，華蟾素注射液組可上調黑色素瘤移植瘤中E-cadherin蛋白的表達水平，這有助于維持細胞連接而抑制間充質蛋白的表達；可下調Vimentin和N-cadherin蛋白的表達水平，從而抑制細胞與纖維連接蛋白的黏附而抑制EMT進程[17]；可降低MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平，從而抑制ECM蛋白降解和細胞侵襲而抑制EMT的發生。以上結果表明，華蟾素注射液可通過抑制黑色素瘤移植瘤EMT的發生，抑制黑色素瘤的增殖以及轉移能力，但其具體分子機制仍有待進一步闡明。