高效液相色譜法和酶放大免疫法檢測伏立康唑血藥濃度相關性分析*

李俊明，卓思珺，陳仕鵬，劉成裕，謝瑞杰

（廣西壯族自治區柳州市人民醫院藥學部，廣西 柳州 545006）

伏立康唑（VRC）為三唑類抗真菌藥，抗菌活性強、抗菌譜廣，臨床應用廣泛［1-2］。VRC在體內呈非線性代謝、個體差異大，劑量與血藥濃度相關性不穩定，應針對患者具體情況并結合血藥濃度結果制訂個體化用藥方案，最大限度發揮療效、減少藥品不良反應［3-5］。高效液相色譜（HPLC）法為檢測VRC血藥濃度的常用方法［6］，而近年酶放大免疫（EMIT）法也逐步用于血藥濃度檢測［7-8］。為探討這兩種檢測方法對VRC血藥濃度的影響，本研究中收集VRC達穩態血藥濃度的真菌感染患者血液樣本59份，分別使用兩種方法進行測定，分析測定結果的相關性，并對我院兩種檢測方法結果進行比較分析，以便臨床正確解讀檢測數據，調整用藥方案。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標準：年齡2～90歲；采血時VRC已達穩態濃度（即負荷給藥24 h后或常規給藥6 d后）。

排除標準：標本量＜4 mL；標本溶血。

樣本收集：收集醫院2019年至2020年住院和門診患者常規VRC檢測樣本2 045份，2019年收集1 054份，其中59份采用2種方法平行檢測，其余均采用HPLC法檢測；2020年收集991份，均采用EMIT法檢測。

1.2 血藥濃度檢測方法

1.2.1 HPLC法

色譜條件：色譜柱為Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為25 mmol/L KH2PO4緩沖液-甲醇-乙腈（55∶15∶30，V/V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為256 nm；柱溫為35℃；進樣量為10 μL。

樣本處理及內標選擇：采用10 % HClO4溶液沉淀蛋白法前處理血清樣本，以硝西泮作內標。

方法學考察：按相關規定進行精密度、穩定性、重復性試驗考察。結果表明，儀器精密度良好，供試品溶液在室溫下放置12 h內基本穩定，方法重復性良好。

1.2.2 EMIT法

按照Viva-E型全自動生化分析儀（西門子醫學診斷產品有限公司，定量范圍為0.5～16.0 μg/mL）的操作規范。取血液樣本，5 000 r/min離心5 min，取上清液，采用EMIT VRC測定試劑檢測。

1.3 統計學處理

采用SPSS 18.0及MedCalc 19.0.4統計學軟件分析。組間差異采用雙側配對t檢驗、配對Wilcoxon檢驗、Passing-Bablok法和Bland-Altman法分析，并對測定結果進行一致性評價。

2 結果

2.1 VRC血藥濃度檢測結果相關性分析

結果見表1。計算可知，兩種檢測方法測得的VRC血藥濃度結果具有高度相關性（r=0.879，P＜0.05）。

表1 HPLC法及EMIT法VRC血藥濃度檢測結果（μg/mL，n=59）Tab.1 Results of serum drug concentration determined by HPLC and EMIT（μg/mL，n=59）

2.2 檢測模型建立及相關性分析

59份樣本的配對樣本t檢驗分析顯示，兩種檢測方法結果間存在顯著差異。以EMIT法血藥濃度（CEMIT）測定結果（Y，μg/mL）為縱坐標，HPLC法血藥濃度（CHPLC）測定結果（X，μg/mL）為橫坐標，建立回歸方程Y=0.054 7+1.743X（n=59），Spearman相關系數為0.923（圖1 A）；配對Wilcoxon測試分析結果顯示，兩種方法結果間存在顯著差異。分別以兩種檢測方法結果的差值（CHPLC-CEMIT）和均值（CHPLC&EMIT）為縱坐標和橫坐標，以95%的置信區間設定血藥濃度的上下限，繪制Bland-Altman偏差圖（圖1 B）。結果顯示，CEMIT為（5.432 2±3.487 98）μg/mL，高 于HPLC法 的（3.283 1±2.052 87）μg/mL，差值的均數（d）值的94.9%（56/59）在95%置信度內。可見，Wilcoxon檢驗和Bland-Altman分析結果均顯示兩種檢測方法的一致性差。

圖1 同一質量濃度下兩種檢測方法血藥濃度結果分析A.Linear regression chart B.Bland-Altman deviation plotFig.1 Serum drug concentration determined by two methods at the same mass concentration

2.3 不同質量濃度范圍的兩種檢測方法相關性分析

HPLC法 檢 測VRC有 效 谷 濃 度（Cmin）范 圍 為1.0～5.5 μg/mL［3，7-8］。按3個質量濃度范圍，將59份樣本分為A組（＜1.0 μg/mL，6份）、B組（1.0～5.5 μg/mL，40份）和C組（＞5.5 μg/mL，13份），并采用Wilcoxon檢 驗，Passing-Bablok回 歸 和Bland-Altman分 析。A組、B組、C組 的 回 歸 方 程 分 別 為Y1=-5.110+7.385X1（n=6），Y2=-0.012 4+1.853X2（n=40），Y3=-38.494+7.584X3（n=13），Spearman相關系數分別為0.771，0.878，0.505。結果表明，A組和B組兩種檢測方法相關性較好，而C組相關性較差。Wilcoxon檢驗結果顯示，兩種檢測方法結果在3個質量濃度范圍內均有顯著差異；Bland-Altman分析結果表明，CEMIT分別比CHPLC高0.27，2.03，3.39 μg/mL，表明3個質量濃度范圍的一致性差。詳見圖2。

圖2 不同質量濃度下兩種檢測方法血藥濃度結果分析A1，B1.Mass concentration＜1.0 μg/mL A2，B2.Mass concentration of 1.0-5.5 μg/mL A3，B3.Mass concentration＞5.5 μg/mL A.Passing-Bablok regression analysis chart B.Bland-Altman deviation plotFig.2 Serum drug concentration determined by two methods under different mass concentrations

2.4 我院患者VRC血藥濃度檢測結果

2 045份樣本主要來源于重癥醫學科、血液科、呼吸科（2019年占92.98%，2020年占92.23%），患者年齡和血藥濃度均符合正態分布。血藥濃度，HPLC法測定結果C為（2.67±1.88）μg/mL，最大血藥濃度為11.76 μg/mL；EMIT法測定結果C為（4.18±2.69）μg/mL，有3例超過峰濃度（16.0 μg/mL）。詳見表2。

表2 我院患者VRC血藥濃度測定結果（n=2 045）Tab.2 Determination results of VRC serum concentration in patients in our hospital（n=2 045）

3 討論

HPLC法被臨床廣泛用于測定各種藥物的血藥濃度［9-10］，具有靈敏度高、專屬性強的優點。但HPLC法測定前需對樣本進行前處理，等待時間長且測定過程復雜，不適用于大樣本量分析測定［11］。EMIT法屬酶免疫分析技術，其檢測基于樣本中的藥物與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）標記的藥物競爭抗體結合位點，與抗體結合后，酶活性發生改變，根據酶活性來確定樣本中待測藥物的濃度［12］。EMIT法所需樣本體積較小，一直是臨床用于確定內源性和外源性物質的工具，具有自動化程度高，樣本處理簡單、快速的優點，適用于急診和大樣本量分析測定。但EMIT法是利用抗原-抗體相互識別并結合來產生檢測信號，與待測藥物具有相同的抗原表面標志（如代謝物、內源性物質等）或抗體有多個抗原結合位點時，會干擾檢測結果；同時，樣本質量、環境溫度等因素也顯著影響檢測結果。因而其靈敏度和準確性相對較低。EMIT法測定人血漿中VRC濃度時，可能無法區分藥物與VRC類似物或代謝產物，導致產生的值更高影響結果［13-14］。

目前，關于VRC目標血藥濃度和用藥方案調整推薦的研究中多數是基于HPLC法的檢測結果。丁記者等［14］及闞智慧［15］對樣本進行對比研究，均發現兩種檢測方法具有明顯的相關性和一致性，LI等［13］對比了419例兒童樣本的測定結果，發現兩種檢測方法存在明顯相關性，但EMIT法測定結果顯著高于HPLC法。本研究結果顯示，兩種檢測方法存在較好的相關性，但總體上EMIT法與HPLC法測定結果有顯著差異。在0～5.5 μg/mL范圍內兩種檢測方法具有很好的相關性。Wilcoxon測試和Bland-Altman分析表明在3個質量濃度范圍，EMIT法結果均較HPLC法高，并存在顯著差異。

因本研究中平行對比的樣本量偏小，故對我院HPLC法（1 054例）和EMIT法（991例）的測定結果進行回顧性分析以作為補充。結果表明，在樣本主要來源科室分布相近、年齡和血藥濃度均符合正態分布的情況下，EMIT法較HPLC法測定結果普遍偏高。

上述研究之所以出現不同的結論，可能與樣本來源有一定關系，已建立的HPLC法線性范圍較窄，樣本測定結果較集中，均與治療窗濃度1.0～5.5 μg/mL接近［15］。丁記者等［14］的研究對象為口服VRC患者，可能病情和所使用藥物種類相對簡單，而LI等［13］的研究樣本主要為兒童，其中大多數接受了造血干細胞移植，同時使用了多種藥物造成干擾。本研究中患者主要來源于重癥監護室，病情和用藥情況復雜，測定結果分布范圍寬。另外，造成結論不一與樣本量也有一定關系，本研究樣本量偏小，回顧性數據欠嚴謹。因此，關于兩種檢測方法的相關性和一致性需更大樣本量、更進一步的深入研究。

綜上所述，EMIT法和HPLC法檢測VRC血藥濃度時，結果總體相關性良好，鑒于EMIT法存在測定結果偏高的可能，建議在臨床檢測時，尤其是對于病情復雜、用藥品種多的患者，應予以關注并作相應調整，同一患者多次檢測應使用同一種方法，以便為臨床提供更準確可靠的個體化用藥依據。