苦杏仁苷對模型大鼠瘀熱互結證的改善作用*

黃全元，楊 斌，羅 俊，謝旭華，盧 曉，以 敏

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學，廣西 南寧 530021；3.廣西壯族自治區柳州市工人醫院，廣西 柳州 545005）

瘀熱互結證是指火熱毒邪或兼夾痰濕壅于血分，搏血為瘀，致血熱、血瘀兩種病因互為搏結、相合為患而形成的一種證型［1］。瘀熱互結于皮膚，可見皮膚黏膜瘀斑、紅腫現象，體溫升高，凝血功能混亂；于肝臟，則導致肝臟功能受損［2-3］。苦杏仁苷是杏、桃、李子、蘋果、山楂、枇杷等薔薇科植物種仁中普遍存在的含氰基糖苷化合物［4］，能調血脂，增強巨噬細胞作用，以減少斑塊數量，增加正常血管腔面積，抑制反饋性管腔增大［5］。苦杏仁苷可減輕腎損傷［6］，改善糖尿病腎病模型大鼠的過度氧化應激、炎癥和腎組織纖維化［7］，還可減輕慢性胰腺炎模型大鼠胰腺纖維化程度，抑制白細胞介素1β（IL-1β）誘導的終板軟骨細胞變性，改善微循環并緩解血液停滯［8］。為此，本研究中利用大鼠瘀熱互結證模型，觀察不同劑量苦杏仁苷對其中醫體征、給藥后不同時間段的體溫、血小板、凝血指標、肝腎功能等的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：CA-1500型全自動凝血分析儀［希森美康醫用電子（上海）有限公司］；XSP-8CE型生物光學顯微鏡（上海長方光學儀器有限公司）；7100型全自動血生化分析儀（日本Hitachi公司）；MC-347型電子體溫計［歐姆龍（大連）有限公司］；SHANDON Excelsion型高級自動組織脫水機（英國Shandon公司）；Thermo-Histocentre3型全自動組織包埋機（美國Thermo公司）；Leica-RM2135型高級組織切片機（德國Leica公司）；漩渦混合器（上海躍進醫療器械廠）。

試藥：苦杏仁苷（成都曼斯特生物科技有限公司，批號為MUST-17042810，純度≥98%）；阿司匹林腸溶片（廣東南國藥業有限公司，批號為170903）；角叉菜膠（美國Sigma公司，批號為CAS9000-07-1）；高活性干酵母（河北馬利食品有限公司，批號為20170704）；水合氯醛（成都市科隆化學品有限公司，批號為CAS302-17-0）；氯化鈉注射液（廣西裕源藥業有限公司，批號為R17080102）；白細胞介素6（IL-6）試劑盒（批號為T12017846）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（批號為S24017847），均購自武漢華美生物工程有限公司；丙二醛（MDA）試劑盒（批號為20180412）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號為20180412），均購自南京建成生物工程研究所；血管內皮生長因子（VEGF）試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號為E20180501A）；Y9醇溶性伊紅（上海國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，福州邁新生物技術開發有限公司）。

動物：SPF級SD大鼠50只，雄性，8周，體質量（210±20）g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號SYXK（桂）2014-0003，實驗動物生產許可證號SCXK（桂）2014-0002。本實驗經廣西醫科大學實驗動物中心倫理委員會批準，于廣西醫科大學實驗動物中心［溫度（22±1）℃，相對濕度40%～70%］飼養及實驗。

1.2 方法

1.2.1 分組、給藥與建模

將50只SD大鼠分為正常對照組（尾靜脈注射等體積生理鹽水）、模型組（尾靜脈注射等體積生理鹽水）、阿司匹林組（灌胃100 mg/kg）及苦杏仁苷高、低劑量組（分別尾靜脈注射40 mg/kg、20 mg/kg），各10只。給予相應藥物或生理鹽水，每天1次，連續7 d。給藥第4天時，腹腔注射1%角叉菜膠溶液（每天1次，連續3 d），給藥第7天時皮下注射20%高活性干酵母溶液（10 mL/kg），以復制大鼠瘀熱互結證模型。

1.2.2 瘀熱互結證表征

注射干酵母溶液后6 h時，將大鼠置冷光源下觀察并評分。中醫表征評分標準：舌質、眼睛、爪甲、尾部無明顯變化記0分；表現微紅、紅潤、瘀斑分別記1，2，3分；舌質紅紫、眼睛紅紫、爪甲紅紫色、尾部出現明顯瘀斑記4分。

1.2.3 體溫測定

于注射干酵母溶液前2 h（基礎體溫）時及注射后1，2，3，4，5，6，7 h時測定大鼠體溫［9-10］，并計算各時點體溫與基礎體溫的差值。

1.2.4凝血指標檢測

注射干酵母溶液后7 h時，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血5 mL，放入抗凝管（含肝素），搖勻，測定血小板計數（PLT）水平；腹主動脈取血1.5 mL，并緩慢注入0.5 mL含109 mmol/L枸櫞酸鈉溶液的塑料管中并充分混勻，3 000 r/min離心15 min，取血漿，測定凝血四項指標［凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）及纖維蛋白原（Fib）］。

1.2.5 肝腎功能指標檢測

注射干酵母溶液后7 h時，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血5 mL，室溫下放置2 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，測定堿性磷酸酶（ALP）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、血尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）的水平。

1.2.6 腎臟病理形態觀察

取血后，迅速對大鼠剖腹，取兩側腎臟，用濾紙吸干腎表面血液后，去包膜稱定質量并計算腎臟指數，固定于10%中性福爾馬林液（經焦碳酸二乙酯處理）中浸泡1 h，常規脫水，石蠟包埋，切片（4～6 μm厚），用蘇木素-伊紅（HE）染色。采用顯微鏡采集病理圖像并分析，觀察腎小球、間質血管是否充盈；系膜細胞、內皮細胞、腎小管結構是否清晰；細胞質豐富、紅染情況；間質血管是否有擴張、淤血，評分標準見表1。

表1 瘀熱互結證腎臟病理形態等級評分標準Tab.1 Rating criteria of renal pathology of heat stagnation and blood stasis syndrome

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 瘀熱互結證表征評分

與正常對照組比較，模型組大鼠中醫表征評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，苦杏仁苷高、低劑量組和阿司匹林組大鼠中醫表征評分均顯著降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠中醫表征及腎臟指數和病理評分比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of TCM symptoms，kidney index and pathological score of rats in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠中醫表征及腎臟指數和病理評分比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of TCM symptoms，kidney index and pathological score of rats in each group（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。表3至表5同。Note：Compared with those in the normal control group，*P＜0.05；compared with those in the model group，#P＜0.05（for Tab.2-5）.

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2.2 體溫

正常對照組大鼠體溫變化不大，溫度均差＜0.5℃。與正常對照組比較，模型組大鼠注射干酵母溶液后2，3，4，5，6，7 h時的體溫顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿司匹林組、苦杏仁苷高、低劑量組大鼠體溫在各時間點的變化幅度均有不同程度降低。詳見表3。

表3 各組大鼠體溫變化比較（±s，℃，n=10）Tab.3 Comparison of temperature changes of rats in each group（±s，℃，n=10）

表3 各組大鼠體溫變化比較（±s，℃，n=10）Tab.3 Comparison of temperature changes of rats in each group（±s，℃，n=10）

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2.3 腎臟病理形態變化

各組大鼠腎臟指數無顯著差異（P＞0.05）。與模型組比較，苦杏仁苷高劑量組大鼠病理評分顯著降低（P＜0.05）。詳見表2和圖1。

圖1 大鼠腎臟病理形態（HE，×200）A.Normal control group B.Model group C.Low-dose amygdalin group D.High-dose amygdalin group E.Aspirin group

2.4 凝血指標

與正常對照組比較，模型組大鼠PLT和Fib水平均顯著升高，APTT，PT，TT均顯著縮短（P＜0.05）；與模型組比較，苦杏仁苷低劑量組大鼠APTT，PT，TT均顯著延長（P＜0.05），苦杏仁苷高劑量組大鼠PLT和Fib水平均顯著降低，APTT，PT，TT均顯著延長，阿司匹林組大鼠PLT水平顯著降低，APTT，PT，TT均顯著延長（P＜0.05）。詳見表4。

Fig.1 Pathological morphology of rat's kidney（HE，×200）表4各組大鼠凝血指標比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of blood coagulation indexes of rats in each group（±s，n=10）

Fig.1 Pathological morphology of rat's kidney（HE，×200）表4各組大鼠凝血指標比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of blood coagulation indexes of rats in each group（±s，n=10）

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2.5 肝腎功能指標

與正常對照組比較，模型組大鼠ALT，AST，BUN，CREA水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，苦杏仁苷低劑量組大鼠ALT和CREA水平均顯著降低，苦杏仁苷高劑量組大鼠AST，BUN和CREA水平均顯著降低（P＜0.05）；阿司匹林組大鼠BUN和CREA水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見表5。

表5 各組大鼠肝腎功能指標比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of liver and kidney function indexes of rats in each group（±s，n=10）

表5 各組大鼠肝腎功能指標比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of liver and kidney function indexes of rats in each group（±s，n=10）

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3 討論

本研究中，瘀熱互結證是由角叉菜膠的“致瘀”和干酵母的“致熱”作用，于營血、脈絡處相互搏結，相結為患，致使全身多個臟腑受損，形成新的特征性復合疾病大鼠模型。中醫瘀熱互結證相關疾病包括心腦血管疾病、血栓性疾病、內臟器官功能障礙、血液系統疾病、傳染性疾病等。阿司匹林不僅具有解熱作用，還能通過抑制環氧合酶抗炎，同時減少血小板中血栓素A2的生成，治療瘀熱互結證的“瘀”和“熱”。瘀熱互結證臨床表現包括：1）體溫升高；2）舌質呈紅紫色、舌下脈絡肉眼可見變粗長，舌體或舌邊有瘀斑出現；3）多個部位有深紫、暗紅或鮮紅色血液流出；4）皮膚、指甲可見瘀點、瘀斑；5）出現卷縮、煩躁不安及譫語、神昏等精神異常；6）實驗室檢查指標，PLT增多，肝腎功能異常，血液黏度增高，腎臟病理性損傷，血液流變學指標異常等［11-16］。

本研究中，模型組大鼠中醫表征評分明顯高于正常對照組，且其體溫較正常對照組明顯升高，說明大鼠瘀熱互結證模型復制成功。推測苦杏仁苷的解熱作用與其減少炎性因子IL-6和TNF-α，從而相應降低下丘腦視前區附近前列腺素E2的分布，下丘腦體溫調節中樞下調體溫調定點，減少產熱有關［17-18］。

淤血的形成與PLT和凝血四項指標變化有關［19］。本研究中，與正常對照組比較，模型組大鼠PLT和Fib水平升高，PT，TT，APTT均縮短；與模型組比較，苦杏仁苷高、低劑量組大鼠PLT和Fib水平均降低，PT，TT，APTT均延長。表明苦杏仁苷有助于瘀熱互結證模型大鼠PLT，PT，TT，APTT和Fib水平恢復正常。ZHANG等［20］研究發現，苦杏仁苷可改善微循環障礙，降低血液黏度。WANG等［21］及KUNG等［22］研究發現苦杏仁苷可降低核因子（NF）-κB水平。

瘀熱互結證病機為濕熱瘀毒互結，侵襲于肝膽，以致肝膽疏泄功能失常，而致肝炎、膽石癥等肝膽疾病，最易表現為肝膽濕熱。瘀熱阻滯在腎和膀胱，導致蓄血，腎氣不固，水府熱結、氣化失司，亦可出現小便不利，甚至少尿，無尿或尿中帶血，如流行性出血熱并急性腎功能衰竭［23］。本研究中，各組大鼠腎臟指數無明顯變化，模型組大鼠肝腎功能異常，腎臟有病理性損傷，苦杏仁苷高、低劑量組上述指標均有改善。推測苦杏仁苷可通過細胞信號通路改變組織細胞的膜穩定性以及細胞核轉錄功能等，提高了實質細胞在瘀熱互結證下缺血缺氧的耐受能力，同時通過改善血液循環功能，促進血液的正常流動和缺氧缺血的恢復，從而保護肝腎細胞。

綜上所述，苦杏仁苷對模型大鼠瘀熱互結證具有良好的改善作用，可降低大鼠體溫，改善瘀斑等體征及保護腎功能。