EB病毒及EB病毒感染相關淋巴瘤發病機制的研究進展

周小楠 綜述 師永紅 審校

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV），又稱人類皰疹病毒4型，屬γ皰疹病毒科。1964年Epstein與Barr首次在Burkitt淋巴瘤（Burkitt’s Lymphoma，BL）中發現該病毒，并命名為EBV。全世界約有95%以上的人口曾感染EBV，絕大多是隱性感染，部分形成傳染性單核細胞增多癥、咽炎等急性感染[1-3]。此外，因在NK/T細胞淋巴瘤、BL、霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma，HL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）等腫瘤及移植后淋巴組織增殖性疾?。╬ost-transplant lymphoproliferative disorders，PTLD）患者的組織中檢測出大量EBV，從而認為EBV與這些類型的淋巴瘤的發生、發展緊密相關，其可能通過抑制免疫系統或誘導不受控制的增殖導致腫瘤的發生。

1 EBV的分子生物學特性及其感染模式

EBV是線性雙鏈DNA病毒，呈球形，基因組長172 kb，主要編碼產物包括EBV增殖感染相關抗原：衣殼抗原（viral capsid antigen，VCA）、早期抗原（early antigen，EA）、膜抗原（membrance antigen，MA），以及EBV潛伏感染時表達的抗原[潛伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP），包括LMP1，LMP2A和LMP-2B。EBV核抗原（Epstein-Barr virus antibody，EBNA），包括EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA-3C和LP]。EBV還表達兩種小核酸RNA（EBV encoded RNAs，EBER），包括EBER1和EBER2，以及微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）。

EBV的生命周期分為裂解和潛伏兩個階段[2]。其在上皮細胞中進行裂解復制，并在循環記憶B淋巴細胞中建立終生潛伏期，從潛伏期開始周期性地重新激活。依據EBV表達潛伏基因種類的不同，可以將其潛伏感染模式分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型4種類型。0型潛伏感染即被EBV感染，處于休眠期的記憶B細胞，僅表達EBV編碼潛伏的RNA即EBERs；Ⅰ型潛伏感染，EBV除表達EBERs外，還表達EBV核抗原EBNA1和BamHIA右側片段（BamHI-A rightward transcripts，BARTs），如BL；Ⅱ型潛伏感染，EBV表達產物包括EBNA1、LMP1、LMP2、EBERs和Bam-HIA片段的轉錄產物等，鼻咽癌、DLBCL、NK/T細胞淋巴瘤和HL等屬于Ⅱ型感染；Ⅲ型潛伏感染，多發生在急性EBV感染或嚴重免疫缺陷個體中，如艾滋病相關非霍奇金淋巴瘤、傳染性單核細胞增多癥、器官移植、使用免疫抑制劑等，涉及6種EBNA、3種LMP和2種EBER[1，4]。

2 EBV相關淋巴瘤

2.1 BL

BL是一種高度惡性的B細胞腫瘤。幾乎全部地方性BL均為EBV陽性。轉錄因子MYC調節細胞周期、DNA損傷修復、蛋白質合成等相關基因的表達，并且促進細胞的增殖[5]。BL的一個重要特征是MYC的移位和激活：MYC和免疫球蛋白基因位點之間的易位導致MYC的過度表達，促進細胞惡變，最后導致BL的發生[6]。p53是重要的腫瘤抑制基因，參與細胞生長調控，促進細胞凋亡。研究認為MYC不僅促進細胞增殖，也參與細胞凋亡的調控，如通過多種途徑包括生長素響應因子（auxin response factor，ARF）/E3泛素連接酶（E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2，MDM2）/p53途徑、核糖體蛋白（ribosomal protein，RP）/MDM2/p53途徑和DNA損傷應答途徑等激活p53，引起細胞凋亡[5]。抑制p53依賴的長非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）漿細胞瘤多樣異位基因1（plasmacytoma variant translocation 1，Pvt1）亞型Pvt1b，可增加MYC水平和轉錄活性，促進細胞增殖。p53激活Pvt1b來抑制MYC，進而抑制腫瘤發生[7]。EBV編碼的LMP1也通過刺激促進細胞增殖、調節炎性反應的鋅指蛋白（zinc finger protein A20，A20）基因的表達來阻斷p53介導的細胞凋亡[8]。有研究表明，核轉錄因子TCF3的激活和EBV編碼的LMP2A，激活B細胞受體（B cell receptor，BCR）調節腫瘤細胞的增殖和活化，導致細胞惡性轉化，進一步與失控的MYC協同，促進細胞存活和BL的發生[9]。此外，EBNA1、EBNA3在BL腫瘤的形成過程中也是不可缺少的。EBV在增殖的宿主細胞中以染色體外遺傳物質附加體的形式存在，EBNA1在DNA復制過程中使單鏈DNA發生交聯，在宿主細胞的分裂過程中介導了附加體的復制和分配，并促進細胞遷移和可能的轉移擴散[10-11]。由此可見，EBNA1對病毒DNA在感染細胞中的持續存在至關重要[11]。研究表明，EBNA1還可以發揮抗凋亡作用，增強腫瘤的致瘤性[6]。證明EBNA1與影響B細胞生長和功能的基因及細胞增強因子、白介素6受體、早期B細胞因子1等相結合，提高EBV潛伏感染細胞的存活率[12]。EBNA3A和EBNA3C介導各種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的抑制，同時還通過抑制病毒感染和轉化的凋亡反應，如抑制促凋亡的B淋巴細胞瘤-2基因（BCL-2）家族成員BIM基因，加強EBV介導的B細胞轉化和隨后的病毒持久性，進一步促進病毒誘導的增殖和腫瘤發生。而腫瘤抑制因子EBNA3B與EBNA3A和EBNA3C作用相反，其失活則促進免疫逃逸和EBV驅動的淋巴瘤發生[13-14]。有研究表明，缺失EBNA2的基因組可表達細胞BCL-2的病毒類似物BHRF1，賦予BL細胞抗凋亡活性和促生長優勢，EBNA2缺失的EBV基因組可以在人源化小鼠中引起類似人類BL淋巴瘤的發生[15]。

2.2 HL

HL的特征是存在霍奇金-李-斯（Hodgkin-Reed-Steinberg，HRS）細胞。利用EBV特異性原位雜交技術檢測到EBER在HRS細胞中的表達，證實了EBV與HL的直接聯系[6]。HL中的EBV基因組也表達LMP1、LMP2A和EBNA1。端粒重復序列結合因子2（telomeric repeat binding factor，TRF2）可通過結合染色體末端并確?；蚪M完整性來介導端粒保護。研究表明，LMP1可以下調TRF2，導致端粒功能障礙、復雜染色體重排和多核性，從而誘導RS細胞的形成[16]。LMP1還可模擬活化的腫瘤壞死因子受體超家族成員CD40的受體，募集細胞內重要的接頭分子腫瘤壞死因子受體相關因子（TNF receptor-associated factor，TRAF）家族成員TRAF1、TRAF2和TRAF3，激活核因子κB（nuclear factor- kappa B，NF-κB）誘導激酶/抑制劑激活酶，使NF-κB抑制蛋白α磷酸化。進一步激活其下游NF-κB信號通路，通過抑制細胞凋亡來促進細胞存活[1,17]。此外，LMP1還可誘導HRS細胞中異常激活的細胞信號通路，如改變細胞中DNA轉錄與活性水平的Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子（the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）通路、激活多種與腫瘤有關的基因如細胞周期素、膠原酶、溶基質素等表達的激活蛋白-1通路和可誘導強效共刺激分子CD137表達的磷酸肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路[18]，有助于HRS細胞的異常轉錄。而LMP2A通過激活脾酪氨酸激酶，不僅導致甲基受體蛋白和PI3K激酶等功能都與B細胞受體相似的分子的激活，促進HRS細胞的生存，還增加NF-κB蛋白核易位，從而增加趨化因子巨噬細胞炎癥蛋白-1α的表達，以維持腫瘤微環境，間接促進了HL腫瘤的生存[9,19]。白介素-2受體CD25、趨化因子配體20（CC chemokine ligand 20，CCL20）在調控免疫細胞分化、發育及定向遷移過程中起重要作用，EBNA1已被證明可誘導HL細胞中CD25和CCL20的表達增強，并通過降低Smad2蛋白的半衰期，下調Smad2的表達，抑制轉化生長因子-β靶基因腫瘤抑制因子蛋白酪氨酸磷酸酶受體K的轉錄，從而促進HL的生成[20]。

2.3 DLBCL

DLBCL是最常見的非霍奇金淋巴瘤[4]。研究表明，在EBV陽性DLBCL的絕大多數病例中均檢測到克隆性重排和體細胞高度突變[21]。進一步研究顯示，EBV陽性DLBCL的形成與NF-κB和JAK/STAT信號通路的激活有關[6,22]。Kato等[23]對EBV感染的DLBCL細胞系進行體外研究和免疫組織化學染色也證實，EBV感染可促進由LMP1C-端胞質結構域觸發的NF-κB的激活和信號傳導及轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）3的磷酸化信號，促進細胞轉錄。聚合酶鏈式反應檢測顯示60%EBV陽性DLBCL的病例存在T細胞受體基因重排“受限”或寡克隆[1]，并且在EBV感染下的T細胞衰老、減少或異常也促進淋巴瘤的發生。研究表明，EBV陽性DLBCL的Ⅱ類主要組織相容性復合體蛋白及其轉錄共激活因子被破壞，BCR信號的完整性及其信號轉導受影響，導致EBV陽性DLBCL的抗原捕獲和提呈系統受損，同時T細胞過度表達細胞程序性死亡受體-配體1（programmed cell death-ligand 1，PDL1），從而誘導T細胞抑制，導致免疫逃避[24]。此外，EBV還可以誘導DLBCL的腫瘤微環境成分的改變，如LMP1通過誘導STAT1依賴的干擾素-γ分泌，促進B細胞增殖；而LMP2A和EBERs潛伏抗原以及EBV基因組的即刻早期基因（EBV-BZLF1）裂解抗原均促進白介素-10（interleukin-10，IL-10）的產生；由病毒抗原如EBER2和BZLF1觸發的白介素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-13（interleukin-13，IL-13）的上調也可能誘導利于EBV感染的腫瘤細胞生長和存活環境的形成[4]。此外，EBV轉化的B細胞下調主要組織相容性復合體Ⅰ類分子的表達、EBNA3B中免疫優勢T細胞表位發生突變，有助于腫瘤細胞逃避宿主細胞毒性T淋巴細胞的殺傷，逃脫宿主的免疫監視[22]。

2.4 PTLD

PTLD主要來源于移植患者的B細胞，通常與EBV感染有關。有文獻報道[25]，約80%的移植后淋巴組織增生性疾病顯示EBV陽性。EBV感染不僅使PTLD表達所有潛伏抗原，也改變了miRNA的表達。Felal等[25]研究表明，miRNA-194過表達可增加EBV陽性B細胞淋巴瘤細胞株的凋亡，并抑制IL-10的產生，PTLD患者的基因陣列顯示miRNA-194表達被抑制。EBV通過抑制miRNA-194來增加IL-10的表達，IL-10過表達會引起免疫抑制，促進PTLD的生成。PTLD的發病機制不僅涉及病毒的感染的作用，還有一些細胞基因的遺傳或表觀遺傳改變。部分PTLD病例的特征是DNA錯配修復機制缺陷導致的微衛星不穩定。此外，PTLD中細胞基因改變還包括細胞凋亡相關的基因如MYC、B淋巴細胞瘤-6基因（BCL-6）、p53的改變、DNA的高甲基化和原癌基因異常體細胞高突變。此外，免疫抑制藥物的使用也促進PTLD的發生。器官移植后免疫抑制藥物的使用雖然提高了移植的成功率，但會導致EBV特異性T細胞耗盡，降低T細胞的數量和功能，破壞免疫系統和潛伏病毒之間的平衡，從而使EBV從潛伏期重新被激活[26]。除此之外，EBV特異性T細胞介導的免疫監視功能受損導致淋巴母細胞增殖失控，最終導致移植受者出現PTLD[27]。

2.5 NK/T細胞淋巴瘤

雖然EBV感染B細胞更常見，但也可感染上皮細胞以及T淋巴細胞或自然殺傷細胞（natural killer cell，NK細胞）[2]。EBV感染NK和T細胞，可導致結外NK/T細胞淋巴瘤（extranodal NK/T-cell lymphoma，nasal type，ENKTL）。ENKTL是一種以結外優先受累、EBV相關性和發病地域多樣性為特征的淋巴瘤[28]。EBV在ENKTL發生中的重要性于1990年首次被認識[28]。盡管NK細胞不表達EBV的主要受體蛋白CD21，但由EBV感染的B細胞通過突觸轉移激活的NK細胞，使其獲得CD21分子，這些異位受體允許EBV與NK細胞結合，從而引發病毒感染[29]；Smith等[30]通過中和抗體試驗，也證明EBV利用病毒糖蛋白gp350和CD21進入成熟的外周T細胞。ENKTL細胞屬于Ⅱ型潛伏感染，表達EBV基因EBNA1、LMP1和LMP2[1]。上述基因的表達已經被證明能夠結構性地激活JAK/STAT、NF-κB等信號通路，從而促進細胞的生長和存活。有研究認為，LMP1在ENKTL中的表達可通過NF-κB途徑上調腫瘤細胞PDL1，來促進腫瘤免疫逃逸[31]；此外，LMP1還通過誘導細胞表面黏附分子CD23、CD40、細胞間黏附分子-1和淋巴細胞功能相關抗原-3的表達，上調抗凋亡蛋白如BCL-2、髓樣細胞白血病蛋白-1、BCL2A1同源體、A20，來抑制細胞凋亡并促進腫瘤的發生[3]。

雖然EBV感染被認為是ENKTL發病機制中的早期因素，但附加的基因改變對于淋巴瘤的形成也是必不可少的。最近的研究中，利用二代測序技術在ENKTL患者中發現了頻繁的JAK3激活突變[32]。ENKTL的基因組分析也顯示，最常見的突變 JAK/STAT信號通路家族的成員，主要是STAT3，其次是腫瘤抑制基因BCL-6輔抑制因子、TP53、RNA解旋酶基因等[28，33]。EBV是激活STAT3的外部因素之一：EBV潛伏蛋白LMP1被認為是STAT激活劑、EBNA2是STAT3轉錄增強子的輔助激活因子以及JAK/STAT級聯反應的下游元件PI3K調節亞基在所有ENKTL樣本中都表達上調，導致細胞增殖和存活。Li等[34]研究證明，鳥嘌呤核苷酸結合蛋白q多肽（guanine nucleotide binding protein q polypeptide，GNAQ）基因通過抑制AKT和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號通路，來抑制ENKTL的生長，體細胞GNAQ T96S突變促進了ENKTL的發病。還有研究認為，ENKTL存在染色體異常，如6q21的缺失，導致許多抑癌基因如自噬相關蛋白5、正性調節區鋅指蛋白1、叉頭轉錄因子O3、黑素瘤缺乏因子1和E3泛素蛋白連接酶的表達缺失，抑制腫瘤壞死因子驅動的NF-κB激活而導致凋亡抵抗，促進ENKTL的發生[28，32]。

進一步表觀遺傳學的研究發現，ENKTL存在細胞周期蛋白的甲基化、組蛋白修飾以及去調控的miRNAs。啟動子甲基化異常是ENKTL常見的致癌機制，可導致BIM、凋亡相關蛋白激酶1、蛋白酪氨酸磷酸酶6、甲基胞嘧啶雙加氧酶2、細胞因子信號轉導抑制劑6和天冬酰胺合成酶等多種抑癌基因的沉默，以及多重腫瘤抑制基因如細胞周期素依賴性激酶抑制劑2A、2B和1A等細胞周期調控基因的沉默，導致細胞正負調節信號不穩定，引起細胞惡性轉化，發生腫瘤[28]。通過負性MYC調控Zeste基因增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）miRNA介導EZH2的上調，使其在ENKTL中發揮致癌特性，促進細胞周期蛋白D1的轉錄，并通過NF-κB信號通路促進腫瘤的浸潤性生長和不良預后[29，32]。表觀遺傳的另一類調節因子是EBV miRNAs，作為癌基因或腫瘤抑制基因發揮作用，誘導轉錄后的基因調控。有研究發現ENKTL存在大量對腫瘤生長有抑制作用的miRNAs，包括miR-146a、miR-26a、miR-26b、miR-28-5、miR-101和miR-363的下調[28]，進而抑制細胞NF-κB通路，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，其下調則促進腫瘤的發生[32]。

EBV誘導ENKTL細胞分泌IL-9[29]，進而刺激腫瘤細胞的增殖和侵襲。ENKTL還可分泌IL-2，通過誘導IL-10和干擾素-γ的產生，活化T細胞，促進細胞因子產生，刺激NK細胞增殖，并通過JAK/STAT通路間接上調LMP1的表達，促進ENKTL細胞生長。腫瘤壞死因子CD70與其受體CD27的連接（CD70/CD27）通路，導致T細胞的活化和增殖。EBV陽性的ENKTL細胞株特異性表達可以調控T細胞活化、增殖的CD70，其可通過與可溶性CD27結合，以劑量依賴的方式在淋巴瘤增殖中發揮作用。另外，CD27/CD70信號可能被LMP1上調[35]，加速ENKTL的進展。

3 結語與展望

EBV廣泛存在于世界各地的人群中[1]。盡管EBV與多種惡性腫瘤的發病機制有關，但其發病機制尚未闡明；雖然EBV體外感染模型已建立多年，但相關潛伏感染和裂解感染的EBV感染的具體策略，尚未明確。未來的研究應集中在復雜的調控網絡與眾多轉錄因子、病毒裂解/潛伏抗原及其相關關系方面。隨著對EBV與控制細胞生長和存活的關鍵細胞通路更多且更深的了解，將逐步解決上述問題，并探索其與癌癥的密切聯系。