KLK14與惡性腫瘤轉移關系的研究進展*

崔欣 葉聯華

隨著分子靶向治療的興起和廣泛應用，惡性腫瘤的診斷和個體化治療取得了積極的進展，但由于惡性腫瘤的高復發和轉移率，目前病死率仍然較高。轉移是惡性腫瘤細胞從原發病灶擴散到遠處器官的過程，涉及包括細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的降解、上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、免疫逃逸、組織微環境的調節和耐藥等多種細胞機制，由于癌癥轉移過程的綜合性和復雜性，對這一復雜現象仍缺乏系統了解，限制了轉移性疾病治療的進展。因此，挖掘與腫瘤轉移顯著相關的新的分子標志物，并探索在腫瘤轉移中的作用，對于深入了解惡性腫瘤的轉移過程及腫瘤的診治具有重要意義。

人組織激肽釋放酶家族（Kallikrein-related peptidases，KLKs）是一類具有胰蛋白酶和糜蛋白酶雙重活性的分泌型絲氨酸蛋白酶，其成員人組織激肽釋放酶14（Kallikrein-related peptidase 14，KLK14）作為癌癥發展過程中重要的信號分子，有望成為癌癥個體化治療的新靶點[1]。大量研究表明KLK14可以調節多種惡性腫瘤的發生和發展，并且參與到腫瘤細胞轉移的各個階段[2-4]。而腫瘤轉移這一惡性腫瘤的基本生物學特性，是導致疾病難治和患者死亡的重要原因，本文將就KLK14在腫瘤轉移中的作用和可能機制進行綜述。

1 KLK14概述

KLK14是KLKs中的一員，其基因定位于染色體19q13.4，全長約5.4 kb，由7個外顯子（5個編碼的外顯子）和4個內含子組成，其生物學功能由編碼產物KLK14蛋白介導，其酶原前體由251個氨基酸構成，包含18個氨基酸構成的信號肽和6個氨基酸構成的活性肽，并具有胰島素樣和糜蛋白樣活性[5]。

2000年，Hooper等[6]通過Northern blot分析以及原位雜交技術首次在正常前列腺上皮細胞、前列腺癌細胞以及骨骼肌中檢測到KLK14基因的表達。KLK14廣泛表達于多種組織，在中樞神經系統中，KLK14中度表達，與其他KLKs共同參與層黏連蛋白、纖維連接蛋白和膠原蛋白等細胞外基質的降解,以及蛋白酶激活受體-2的激活[7]。KLK14在皮膚中表達，激活皮膚脫屑的主要效應物KLK5和KLK7，并在體外直接降解橋粒核心糖蛋白-1，進一步參與表皮生理學[8]。而在惡性腫瘤細胞中觀察到了KLK14表達的失調。研究發現，KLK14受類固醇激素的調節[9]，在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌中對比正常組織均有不同程度的升高[4，9]，而隨著對KLK14更深入的研究，在包括結直腸癌和非小細胞肺癌等非激素依賴性腫瘤中均發現KLK14的異常表達[10-11]。KLK14可以通過激活HGF/c-MET信號通路、膜型基質金屬蛋白酶和降解細胞外基質等多種途徑促進腫瘤細胞的浸潤和轉移[2，12]。

2 KLK14和腫瘤轉移

腫瘤轉移是惡性腫瘤的顯著特征，也是導致癌癥患者死亡的重要因素。近年來，越來越多的惡性腫瘤中發現了KLK14的異常表達，研究者推薦將KLK14作為惡性腫瘤轉移及較差預后的分子標志物，并提出將其作為新的靶點以達到腫瘤治療的目的。

2.1 KLK14與激素依賴性腫瘤

研究發現，KLK14受類固醇激素調節促進腫瘤進展和轉移[9]。有研究表明，與正常前列腺組織相比，前列腺癌中KLK14的表達升高。Rose等[13]通過對TCGA數據庫中前列腺癌的數據分析表明，高Gleason評分前列腺癌的KLK14 mRNA表達顯著高于低Gleason評分的前列腺癌。特別是在檢測到前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen/Kallikrein-related peptidase 3，PSA/KLK3）的復發患者中[14]。同時，與原發性前列腺癌相比，轉移性前列腺癌中KLK14的表達顯著升高[3]。KLK14與前列腺癌的關聯也得到了遺傳學研究的支持，KLK14基因的多態性與前列腺癌侵襲性顯著相關[13]。以上證據提示靶向該基因可能提供一個新的途徑來限制前列腺癌的進展和轉移。KLK14在其他內分泌腫瘤中同樣高表達，Georgia等[15]研究表明，在乳腺癌和正常組織標本中的表達分析顯示，惡性腫瘤中KLK14的轉錄水平較正常組織更高，定量KLK14的表達可以作為乳腺良惡性病變鑒別診斷的獨立生物標志物，同時，KLK14轉錄水平升高與腫瘤的形態大小呈正相關，且較高的KLK14基因水平與乳腺癌的侵襲性相關。在卵巢癌中，KLK14的表達水平高于正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤[9]。Zhang等[16]利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）下調KLK14基因在人卵巢癌細胞SK-OV-3和OVCAR-3中的表達，發現抑制KLK14可明顯降低細胞的增殖和侵襲能力并增加細胞凋亡率，表明KLK14可能是治療和抑制卵巢癌轉移的潛在靶點。

而Dettmar等[17]在晚期高級別漿液性卵巢癌中觀察到KLK14的表達與腫瘤預后呈負相關。相似的，在睪丸癌中，KLK14轉錄水平的表達相比正常組織下調[18]，但目前還無關于其與睪丸癌生存率相關性的研究。提示KLK14在不同種腫瘤細胞中可能存在雙向調節，但其機制仍需進一步闡明。

2.2 KLK14與非激素依賴性腫瘤

隨著研究的深入，在越來越多的非激素依賴性腫瘤中同樣發現了KLK14表達的上調。由于結腸癌中可用標記物缺乏敏感性和特異性，Devetzi等[10]利用實時熒光定量PCR技術，檢測了175例患者的245份結腸組織標本，證實KLK14在結腸癌中轉錄水平上調。進一步的受試者工作特征曲線分析顯示，KLK14基因表達可作為結腸癌患者預后不良的生物標志物，并對結腸癌和腺瘤患者有較強的鑒別能力，而KLK14轉錄水平上高表達與陽性淋巴結狀態和更晚的TNM分期具有顯著性相關，分別為P=0.019和P=0.043，提示KLK14在結腸癌轉移中發揮促進作用。

而KLK14在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的表達存在爭議，Planque等[19]采用qPCR技術，分析了57例原發性NSCLC患者配對樣本中的KLK14 mRNA表達水平，與配對的癌旁組織相比，KLK14在NSCLC組織中高表達（P=0.022），進一步研究發現KLK14還與NSCLC的高風險相關，證實了KLK14可作為NSCLC患者預后的潛在生物標志物。而Tailor等[20]利用TCGA數據庫分析了KLKs家族中的所有成員在15種腫瘤中的表達水平，結果顯示在肺鱗癌和肺腺癌中KLK14的表達與正常組織比較差異無統計學意義 。Zhang等[21]通過對112例宣威女性肺腺癌和配對樣本進行全外顯子測序，利用mRNA-Seq技術對33例正常和115例腫瘤樣本進行測序，并與TCGA數據庫比較，將KLK14鑒定為顯著突變基因，是潛在的宣威女性肺腺癌的驅動基因。然而關于KLK14對NSCLC轉移的影響及可能機制則需進一步研究。

3 KLK14促進腫瘤轉移的分子機制

惡性腫瘤轉移是一個多步驟的級聯過程，包括局部侵襲，癌細胞進入附近的血管/淋巴管，進而到達遠處組織形成微轉移，最后定植形成轉移灶 。而蛋白酶在癌癥進展的幾乎所有階段都起著十分復雜的作用。特別是蛋白酶參與到了一些癌細胞從原發部位轉移到繼發部位的必要細胞事件[1]。KLKs可以通過降解ECM、促進EMT、免疫逃逸和促進血管生成等途徑促進腫瘤細胞浸潤轉移。KLK14是KLKs家族中發現的新成員，可能在上述細胞生物學程序的調控中發揮重要作用，促進腫瘤細胞轉移。

3.1 KLK14與ECM

ECM（extracellular matrix，ECM）是由細胞合成、分泌的生物大分子，在細胞表面或細胞之間構成復雜的網絡結構，經典意義上的ECM包括膠原蛋白、彈性蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖及非膠原蛋白。KLKs家族在是維持ECM穩態所必須的蛋白水解酶，參與ECM重構[22]。而ECM重構可以促進血管生成過程中內皮細胞的遷移，以介導血管生成的方式促進惡性腫瘤轉移。ECM在腫瘤細胞侵襲和轉移中起關鍵作用，腫瘤細胞可以通過分泌各種酶類降解ECM，從而向周圍及遠處組織侵襲轉移。

Kryza等[3]通過對前列腺癌細胞的蛋白質組學進行分析，發現包括硫酸肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPG）、集聚蛋白（agrin，AGRN）、多配體蛋白聚糖4（syndecan 4，SDC4）和模塊化結合蛋白2在內的KLK14底物參與了ECM的形成，同時發現KLK14可以調節解整合素金屬蛋白酶10（a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10）和ST14蛋白酶的活性，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。KLK14還可以通過選擇性激活膜型基質金屬蛋白酶（membrane-type matrix metalloproteinases，MT-MMPs）參與癌細胞轉移的初始階段[2]。在卵巢癌中也觀察到了相似的結果，Zhang等[16]將KLK14小干擾RNA轉染到人卵巢癌SK-OV-3和OVCAR-3細胞中并進行Western blot分析，結果顯示存活蛋白（survivin）和MMP2的表達降低。Rajapakse等[4]將KLK14表達載體轉染到卵巢癌細胞COS-7中，并活化和純化重組KLK14蛋白進行生化和酶學表征，發現KLK14蛋白在卵巢癌中降解層黏連蛋白、纖維連接蛋白、I型膠原和IV型膠原，而這些ECM成分蛋白的降解被認為是癌細胞侵襲和轉移的關鍵步驟。以上研究表明KLK14可以通過降解ECM或影響ECM重構促進腫瘤細胞的轉移。

3.2 KLK14介導EMT

EMT（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是癌細胞發展侵襲性表型所必需的，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的減少和波形蛋白表達增加是EMT的顯著特征[23]。有研究表明KLKs家族在調節EMT相關機制中發揮作用[24]。

蛋白酶激活受體-2（proteinase-activiated receptor-2，PAR-2）屬于G蛋白偶聯受體，作為各種蛋白水解信號傳遞的靶點參與到包括腫瘤在內的多種病生理過程[25]，可被KLKs家族激活。有研究表明，PAR-2的表達在多種惡性腫瘤中顯著升高，并且可以通過促進腫瘤細胞侵襲和轉移加速腫瘤進展。在肝癌細胞中PAR-2的激活可以誘導人肝癌LX-2細胞形成EMT所特有的絲狀偽足，并且可以通過 Src 蛋白激酶、Met蛋白、p42/P44 MAPK 信號通路和 MMP 依賴的方式增加腫瘤細胞的遷移能力[26]。Wu等[27]利用TCGA數據庫進行生物信息學分析發現，PAR-2過表達有利于肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，進而影響患者的預后。同樣，Tsai等[28]研究發現，在肺腺癌細胞系CL1-5和H1299中，PAR-2通過Slug介導的EMT促進腫瘤細胞遷移。Chung等[29]發現KLK14和PAR-2在結腸癌細胞中過表達，并且在人結腸癌HT-29細胞中，KLK14可以通過自分泌/旁分泌的方式裂解和激活PAR-2，利用共聚焦顯微鏡觀察到經KLK14處理后的PAR-2迅速內化并在胞內彌漫性定位，進而發揮促癌作用。這些結果表明，KLK14可以激活PAR-2并通過其下游信號途徑介導的EMT促進腫瘤細胞的轉移。

然而，由于KLKs家族中的其他成員，如KLK6抑制乳腺癌進展可能是通過抑制EMT介導[30]。因此，關于KLKs家族促進還是抑制EMT尚未形成共識，仍需要更多的研究加以闡明。

3.3 KLK14與免疫逃逸

免疫系統是腫瘤發生和發展的重要障礙，惡性腫瘤細胞可以通過消除誘導效應細胞、破壞關鍵信號通路、對細胞毒性的抗性以及逃避免疫反應的策略逃避免疫系統[31]。有研究發現KLKs家族與免疫逃逸機制間存在聯系，如KLK5和KLK7可以通過降解LL-37進而介導免疫-腫瘤微環境的調控[32]。

KLK14能有效降解補體系統級聯反應的中心組分補體C3[33]進而發揮外部補體的作用。補體網絡是先天免疫系統的重要組成成分，補體C3是免疫細胞激活中發揮廣泛生物學效應的主要信號效應分子之一。因此，補體C3的水解激活構成了可能有助于腫瘤免疫逃逸的機制。但由于相關研究有限，KLK14與免疫逃逸之間的具體作用機制需要進一步研究。

3.4 KLK14與HGF/c-Met信號通路

肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是由間質細胞產生的一種活性多肽，是致癌基因c-Met目前唯一已知的配體，在正常細胞中HGF激活c-Met后，細胞質中酪氨酸殘基發生自身磷酸化，從而激活酪氨酸激酶。隨后，多種效應蛋白被快速磷酸化發揮復雜的生物學功能[34]。HGF/c-Met信號通路在多種癌細胞轉移的多個階段均發揮關鍵作用，可以促進細胞增殖、侵襲和遷移[35]。HGF可以導致細胞間連接的不穩定、支持細胞骨架重構、控制整合素功能并刺激MMP介導的ECM蛋白水解，進而促進腫瘤細胞侵襲和轉移[36]。一項研究也表明，胰腺癌細胞可通過上調MMP-9從而激活HGF/c-Met信號通路，促進胰腺癌以神經周浸潤的方式形成腫瘤轉移和局部復發[37]。另外，研究表明，HGF/c-Met信號通路可通過細胞可塑性中的關鍵作用和增加與腫瘤微環境的串擾促進免疫逃逸[38]。

Reid等[14]提出KLK14可以通過激活HGF影響HGF/c-Met信號級聯。更深入的研究發現，KLK14以蛋白水解的方式抑制肝細胞生長因子激活物抑制劑-1（hepatocyte growth factor activator inhibitor type-1，HAI-1），而HAI-1可以顯著抑制HGF的激活[12]。綜上所述，KLK14可能通過HGF/c-Met信號通路的激活促進腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉移和免疫逃逸。

3.5 KLK14與胰島素樣生長因子結合蛋白-3

胰島素樣生長因子結合蛋白-3（insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3）是一種p53抑癌基因調控蛋白，是腫瘤發生的負性調控因子。其特異性受體IGFBP-3R已經被證明與IGFBP-3誘導的癌細胞核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）活性的抑制有關，進而增強對腫瘤生長、侵襲和轉移的抑制作用[39]。自分泌移動因子（autocrine motility factor，AMF）又稱磷酸葡萄糖異構酶（phoshoglucose isomerase，PGI）是一種腫瘤細胞分泌的細胞因子，可通過自分泌途徑進入胞內調節細胞遷移和增殖，而IGFBP-3被證明能夠在人乳腺癌細胞T47D和MCF-7中抑制AMF/PGI誘導的細胞遷移[40]。在胰腺導管腺癌中，腫瘤組織相比正常胰腺組織中的IGFBP-3R表達降低，且與預后不良相關[41]。目前的研究結果均表明，IGFBP-3/IGFBP-3R信號通路可能是一種新的抗腫瘤/抗轉移信號通路，是新的潛在癌癥治療靶點[42]。

研究發現，KLK14蛋白具有胰蛋白酶樣活性，并且能夠快速水解IGHBP-3[4]。基于以上研究，KLK14可能在體內通過水解IGFBP-3抑制IGFBP-3/IGFBP-3R信號通路，進而促進腫瘤細胞的轉移，但仍需要更多的研究進行驗證。

4 結語及展望

精準醫學是隨著人類社會的健康需求提高和科學技術不斷發展而興起的新的醫療理念和模式，分子標志物的發現和應用是未來我國精準醫學的重點任務。KLK14參與多種病理生理過程，并與包括侵襲和轉移在內的多種腫瘤細胞惡性生物學行為顯著相關，這提示KLK14在腫瘤的診斷、治療及預后中具有巨大的潛在研究價值。至今，在多種腫瘤細胞中都觀察到KLK14表達的上調，檢測其表達可以反應腫瘤狀態，有效預測患者預后。而在睪丸癌和晚期高級別漿液性卵巢癌中存在KLK14表達下調則提示，KLK14在不同惡性腫瘤中可能存在雙向調節。最近，在宣威女性肺腺癌中的發現將KLK14鑒定為潛在的驅動基因，為全球死亡率最高的區域性肺癌的診斷及精準治療提供了新的潛在靶點。同時，由于KLK14下游靶點的信號通路和蛋白水解級聯反應的多樣性，其在調節惡性腫瘤轉移之外還參與包括腫瘤細胞增殖和血管生成等多種生物學行為的改變。隨著研究的不斷深入，KLK14有望為惡性腫瘤的診斷及個體化治療提供新靶點和新思路。