一起致犢牛肺炎牛支原體的分離鑒定

孟凡艷，王 旭，吳桐忠，張星星，韓猛立，張 倩，鐘發鋼，張滿義，張乾義，胡建軍，黃 新

（1.新疆農墾科學院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000；2.塔里木大學 動物科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300；3.新疆方牧生物科技有限公司，新疆 圖木舒克 843999；4.中國獸醫藥品監察所，北京 100081）

牛支原體（Mycoplasma bovis）是引起牛肺炎、乳房炎、關節炎、中耳炎、角結膜炎、腦膜炎、心內膜炎等多種疾病的病原體，也是牛呼吸道疾病綜合征（BRDC）的主要參與者［1］。1961年，美國首次從患有乳腺炎的牛乳中分離獲得該病原［2］。1983年，陳嘉棣等［3］首次從患有乳房炎的乳樣中分離到牛支原體；2008年，辛九慶等［4］首次從患肺炎的犢牛肺臟病料中分離到該病原；2011年，姚永進等［5］經過分離鑒定確定新疆北疆某些奶牛場犢牛出現嚴重肺炎的病原為牛支原體。牛支原體是導致犢牛呼吸道癥狀的一種重要病原，牛支原體病的發生和流行，造成了養牛場較高的犢牛死淘率與重大經濟損失。

牛支原體侵染犢牛會引起犢牛支氣管肺炎、關節炎、角膜結膜炎等疾病，但引起犢牛呼吸系統疾病的報道較多［6-8］。研究表明，牛支原體定殖在犢牛的鼻腔不會導致犢牛發病，當出現斷奶、運輸、劇烈的天氣變化等應激因素導致犢牛免疫力下降時，牛支原體會侵襲犢牛的呼吸系統，引起一系列的臨床癥狀，包括咳嗽、喘、腹式呼吸等［9-10］。為了解病原攜帶狀態的犢牛在整個牛群里所占的比例，我們特地選取了石河子地區集約化奶牛場無臨床癥狀犢牛的鼻拭子樣品，使用PCR技術檢測犢牛的感染狀態，并通過分離鑒定進一步確定，為更好地預防犢牛支原體感染提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2020年9月，石河子地區某規?；膛?月齡犢牛發生以呼吸道癥狀為主的疫病，發病率為30%，病死率為40%～50%。采取2頭發病犢牛的肺臟組織，并對該場2月齡犢牛進行鼻拭子樣品采集，所有的樣品運送到實驗室并置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 主要試劑及儀器 PCR Super Mix、DL2000 DNA Marker，北京全式金生物技術股份有限公司產品；DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根生化科技(北京）有限公司產品；PPLO肉湯、PPLO瓊脂、生化鑒定試管，青島海博生物技術有限公司產品；丙酮酸鈉、氨芐青霉素鈉，北京索萊寶科技有限公司產品；CO2培養箱，eppendorf公司產品；體視顯微鏡，Leica公司產品；PCR儀，ABI公司產品；電泳儀，北京六一生物科技有限公司產品；凝膠成像系統，Bio-Rad公司產品。

1.2 檢測方法與過程

1.2.1 臨床癥狀觀察及剖檢記錄 2頭發病犢牛的肺臟組織表面出現大小不一的結節狀突起以及不同程度的出血和肉變；采集的鼻拭子樣品中有15.56% (7/45）的犢牛表現出呼吸道癥狀，包括咳嗽、膿鼻涕、呼吸音異常、發熱等。

1.2.2 樣品的PCR檢測 對所采集的樣品，根據DNA提取試劑盒說明書提取樣品基因組DNA。以樣品基因組DNA為模板，參照Pinnow等［11］使用套式PCR方法擴增牛支原體的oppD/F基因，一 輪PCR擴 增 引 物 序 列 為：5′-TTTTAGCTCTT TTTGAACAAAT-3′，5′-GGCTCTCATTAAGAA TGTC-3′；二輪PCR擴增引物序列為：5′-CCAG CTCACCCTTATACATGAGCGC-3′，5′-TGACTC ACCAATTAGACCGACTATTTCAC-3′。

預計擴增片段為442 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應體系20 μL：Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，48 ℃/55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s/30 s，進行20個/35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳檢測，將陽性產物送至安徽通用生物工程有限公司進行測序。

1.2.3 病料接種培養 將泡過肺臟病料與鼻拭子的上清使用0.22 μm濾膜過濾，吸取300 μL濾液至分裝好的3 mL PPLO肉湯中，混勻標記為L1，將其置于5 %CO2恒溫培養箱中37 ℃培養3 d。選擇液體顏色由紅色變為黃色的培養液，連續傳代2次。液體傳代完成后，取適量菌液進行10倍梯度稀釋，連續稀釋3次；取200 μL稀釋的菌液滴加至PPLO固體培養基中央，不斷旋轉平板使菌液在瓊脂上方均勻擴散，標記為固體S1代，將固體S1放入CO2培養箱中，倒置培養3～5 d。待培養基長出針尖大小的菌落時，在顯微鏡下觀察菌落的形態特征；挑取典型的“煎蛋樣”菌落接種于固體培養基，純化3次后，于-80 ℃甘油中保存純化完成的菌株。

1.2.4 Dienes染色 參照吳移謀等［12］的方法，先將Dienes染液用超純水稀釋10倍，然后覆蓋于支原體培養的固體培養基表面上，染色1 min后，用超純水洗去染液，在顯微鏡下觀察支原體菌落中心的顏色；如果菌落中心能明顯著色且呈現深藍色，則為支原體菌落。

1.2.5 生化試驗 參照陸承平［13］的方法，根據生化試管說明書，選擇葡萄糖發酵、精氨酸水解及甘露醇發酵等試驗進行操作。

1.2.6 菌株的PCR鑒定 純化后的菌液使用基因組DNA提取試劑盒提取分離株的基因組DNA。以國際標準株PG45的基因序列為模板，使用軟件primer 5.0設計PCR引物，擴增牛支原體16S rRNA基 因，引 物 序 列：5′-GCGAAGGCAGCTAACTG GGCAT-3′、5′-CTCGGGCAGTCTCCTTAGAGTGCTC-3′，預計擴增片段大小為429 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應體系20 μL：Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳檢測，將陽性產物送至安徽通用生物工程有限公司進行測序。使用MEGA 6.0軟件，構建牛羊源支原體屬常見菌株16S rRNA序列的遺傳進化樹，進行遺傳進化分析。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果

使用牛支原體oppD/F基因對2份肺臟樣品進行檢測，均為PCR陽性；對45份鼻拭子樣品進行檢測，PCR總陽性率為51.11% (23/45）。將陽性結果與臨床癥狀相結合發現，具有呼吸道癥狀的犢牛陽性率為28.57% (2/7），無臨床表現的犢牛陽性率為55.26% (21/38）（表1）。

表1 鼻拭子樣品檢測結果

2.2 分離培養結果

對PCR鑒定為陽性的肺臟病料與鼻拭子樣品進行分離培養，共獲得了3株病原菌，均來自鼻拭子樣品，其中1株來自出現呼吸道癥狀的犢牛，2株來自無癥狀的犢牛，分別命名為Mb-SHZ01、Mb-SHZ02、Mb-SHZ03；使用王展慧等［14］的改良Thiaucourt’s固體培養基培養3 d后，在光學顯微鏡下觀察，分離物與牛支原體典型菌落形態一致，呈“煎蛋樣”（圖1）。

圖1 分離株的菌落形態（40×）

2.3 Dienes染色

分離株經Dienes染色后，菌落中心呈深藍色，而邊緣形成淺藍色的透明圈，且30 min內不褪色（圖2），與牛支原體特征性菌落著色相符。

圖2 分離株Dienes染色結果（63×）

2.4 生化試驗結果

由表2可知，Mb-SHZ01、Mb-SHZ02、Mb-SHZ03均不發酵葡萄糖，不分解甘露醇，不能水解精氨酸，符合牛支原體的生化試驗特征。

表2 生化鑒定結果

2.5 PCR鑒定結果

以分離株基因組DNA為模板，以牛支原體16S rRNA通用引物擴增，出現429 bp左右的條帶（圖3），與預期的目的條帶大小相符。

圖3 分離株16S rRNA引物PCR擴增結果

將牛支原體16S rRNA引物PCR擴增產物測序結果在Gen Bank中進行BLAST比對，發現分離株與牛支原體國際菌株NADC59(CP042939.1）的同源性最高，同源性均高達99.25%以上。使用Mega 6.0軟件，運用Neighbor-joining法，對分離株與牛羊源支原體屬常見菌株的16S rRNA序列構建進化樹（圖4）。從圖4中可以看出：分離株與牛支原體聚在同一分支；精氨酸支原體、關節炎支原體、牛眼支原體、綿羊肺炎支原體、殊異支原體親緣關系較近；山羊支原體與絲狀支原體位于同一分支；進一步證明了分離株為牛支原體。

圖4 分離株與其他支原體16S rRNA序列的遺傳進化樹

3 討論

牛支原體病常見的診斷方法有血清學診斷、分子生物學診斷、分離培養等。選擇PCR檢測鼻拭子樣品的原因是在動物個體水平上，PCR技術可以檢測到間接排菌的現象［15］。oppD/F基因是牛支原體的1種特異性基因，檢測臨床樣品中的牛支原體，敏感性可達5 CFU/mL［16］。本實驗使用牛支原體oppD/F基因特異性套式PCR方法檢測臨床樣品，檢測結果真實可靠。同時，實驗室對呼吸道合胞體病、副流感三型、牛傳染性鼻氣管炎病毒等進行了PCR檢測，均為陰性。

研究結果表明，無癥狀犢牛牛支原體感染的陽性率高于臨床癥狀明顯的犢牛，病原攜帶狀態的犢牛在群體中占有極大的比重，因此要做好犢牛的日常管理工作。共分離到3株病原菌，其中1株來自出現呼吸道癥狀的犢牛，2株來自無癥狀的犢牛，2份肺臟組織未分離到牛支原體。這與國外學者近幾年的研究結果極為相似，即在沒有任何臨床異常癥狀的情況下，從犢牛鼻拭子中分離到了牛支原體，且分離率高達34.3% (12/35）［17］。這與國外早些年的研究結果相反，Gourlay等［18］表示，健康牛幾乎不向外界排菌，樣本中也很難分離到牛支原體。本實驗室未從肺組織樣本中分離到牛支原體，可能是由于牛支原體在肺組織中的濃度過低［19］。

本試驗共獲得3株牛支原體菌株，試驗前期牛支原體菌落生長不良，形態過小，無法挑取單個菌落；后期將培養基中葡萄糖和丙酮酸鈉的含量由2 g/L提高到4 g/L后，牛支原體生長密度適宜且形態特征明顯。可能原因是丙酮酸鈉為碳源，碳源充足方可保證牛支原體的生長。因支原體細胞壁缺失，革蘭染色著色不良；使用狄氏染色后，中心呈深藍色，邊緣為顏色較淺的透明圈。生化試驗結果符合牛支原體的特征。本研究對新疆犢牛支原體肺炎的診斷具有一定的指導作用，為今后開展牛支原體疫苗制備等研究奠定了基礎。關于分離株的耐藥情況及疫苗制備方面還有待進一步試驗研究。