黃果百香果莖段愈傷組織培養脫毒及脫毒苗快繁體系建立

周美玲，曾 軍*，張志勇，蔡建榮，江 巍，張文斌

（1.龍巖市農業科學研究所，福建 龍巖 364000；2.龍巖市新羅區良種繁育場，福建 龍巖 364000）

0 引言

百香果，學名西番蓮，系西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（Passiflora）的一種攀緣木質藤本植物，原產于南美洲巴西等地，在我國主要分布于廣東、福建、廣西、云南、浙江等地［1-3］。近年來，隨著國內百香果的種植面積逐年增大，市場對種苗的需求量也越來越大。然而，目前以扦插、嫁接、實生苗繁殖為主的百香果種苗普遍存在質量參差不齊、苗木帶病毒等問題，制約了百香果產業的進一步發展。現發現危害侵染百香果的病毒共有26種［4］，田間癥狀主要表現為葉片花葉、環斑、皺縮、壞死、黃葉、畸形、死頂、果實畸形、木質化等，植株發病率一般在30%～40%，嚴重的達90%以上。因此亟須開展百香果無病毒優質種苗的繁育技術研究，從源頭上控制病毒病的發生危害，確保百香果產業的持續健康發展。

目前，培育無病毒植物苗木的方法通常是莖尖組織培養技術。莖尖培養可以從植物組織中脫除病毒，形成無病毒植株。莖尖大小對成活率和脫毒率具有很大的影響，莖尖越大，分化率和成活率越大，但脫毒率越低；莖尖越小，雖然脫毒率提高，但分化率和成活率又大大降低，易造成外植體死亡，導致組織培養脫毒失敗［5］。因分生組織中不存在病毒，可采用成熟組織作為外植體，誘導其產生愈傷組織，通過提取其中的部分分生組織，培育出由分生組織分化的脫毒苗木。該方法在脫除植物病毒方面具有明顯優勢：（1）操作極為方便，無須借助體視顯微鏡。（2）分化率和成活率更高。傳統莖尖培養的脫毒苗，由于外植體太小，外植體分化為組培苗的難度較大，接種后的外植體易死亡，導致成苗率較低。采用成熟組織作為外植體，分化率和成活率相對更高。（3）采用成熟組織作為外植體，即使生成的脫毒苗較少，也可以通過組織培養技術進行快速繁殖，不影響脫毒培養［6］。

近年來，國內在百香果離體再生體系研究方面取得了一定的進展，主要以子葉、下胚軸、莖段、胚乳、子房、根、腋芽、卷須等作為外植體建立的離體再生體系，品種多以紫果百香果為主［7-8］，而利用百香果成熟組織為外植體建立再生體系并獲得脫毒組培苗的研究鮮見報道。本研究以福建百香果3號（黃果百香果）的成熟莖段為材料，將其滅菌處理后，進行愈傷組織誘導、不定芽誘導分化成苗，經病毒檢測后，挑選病毒陰性的繼代苗擴大繁殖，直至長出良好的根系后馴化、移栽，以期為今后工廠化繁育無毒健壯優質的百香果種苗提供技術依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

在龍巖市農業科學研究所大棚內選取長勢良好的福建百香果3號新抽10～20 cm的枝條作為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的滅菌 將取回的嫩枝剪除葉片，用自來水沖洗干凈，置于1%洗衣粉溶液中浸泡5 min，再用流水沖洗干凈。將沖洗好的材料放入滅菌玻璃瓶中并置于超凈工作臺上，用75%酒精消毒10 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%的HgCl2溶液浸泡10 min。在滅菌過程中需輕搖晃滅菌瓶，以保證滅菌劑全面浸泡外植體。滅菌完后再用無菌水沖洗4～5次，每次間隔3～5 min，最后用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，備用。

1.2.2 莖段愈傷組織的誘導 試驗設5個處理以MS培養基為基礎培養基，添加不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L）的6-BA至MS培養基，每個處理各5瓶。將滅菌過的枝條剪成長度為0.8～1.2cm的無芽莖段，接種于培養基中，每瓶接種3個莖段（用鑷子將莖段直立插入培養基中），2次重復，于接種后第30天統計愈傷組織的出愈率及生長情況，探討不同激素組合對百香果莖段愈傷組織誘導的影響。出愈率［9］的計算公式為：

1.2.3 愈傷組織不定芽的誘導分化 將誘導出的愈傷組織切割為0.5 cm2左右的小塊，接種到MS培養基，添加不同濃度6-BA、NAA、土豆泥至培養基中。分別以6-BA添加量、NAA添加量、土豆泥用量為試驗因素，每個因素設定3個水平（表1），利用L9（34）正交試驗，以芽誘導率為指標，確定最佳的組合。每個處理接種15瓶，2次重復。于第30天統計愈傷組織不定芽的分化率及生長情況，探討不同處理組合對百香果愈傷組織不定芽誘導分化的影響。芽誘導率［10］的計算公式為：

表1 正交試驗的因素水平

1.2.4 不定芽誘導成苗培養 將誘導分化培養所得的不定芽分成單株，接種到MS培養基，添加不同濃度和組合的NAA、IBA的不定芽誘導生根成苗培養基中，設置3個處理，每個處理接種5瓶，每瓶接種1個芽，3次重復。于第30天統計生根率及根系生長情況，探討不同激素濃度組合對百香果不定芽誘導生根成苗的影響。生根率［11］的計算公式為：

1.2.5 病毒檢測 待增殖培養的苗木數量達到較大時，挑選出生長最健壯的20瓶，分別對其進行編號，每個樣品取50～100mg葉片提取總核酸，采用酶聯免疫吸附法RT-PCR進行鑒定。對百香果斑駁病毒（PaMV），夜來香花葉病毒（TeMV）、東亞西番蓮病毒（EAPV）、西番蓮潛隱病毒（PLV）、黃瓜花葉病毒（CMV）等5種病毒分別采用各自病毒的特異引物進行檢測；20 μL反轉體系中，RNA加入量為1μL；PCR循環數為31個循環。

1.2.6 脫毒苗擴繁培養 對經檢測已脫毒的脫毒苗株系進行擴繁培養基篩選。以MS為培養基，添加6-BA（0.5 mg/L）、不同濃度的IBA（0.1、0.2、0.3mg/L）及蔗糖（20、30 g/L）共配置6種培養基，將選取組培苗單節（帶芽）莖段扦插在培養基上，每個處理接種10瓶，每瓶接2個莖段，生長30 d后，調查株高、莖粗、鮮重以確定不同配比培養基對脫毒組培莖段成苗的影響。

1.3 數據分析

本試驗數據采用DPS軟件包建立數據庫，完成正交試驗設計及統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理對百香果莖段愈傷組織誘導的影響

外植體接進培養基培養7 d后，莖切面的切口處開始膨大，10～12 d后在切口處開始形成淺綠色的愈傷組織點，再經過一段時間培養后，愈傷組織上形成嫩綠色的芽點，后續生長出不定芽。從30 d后的統計結果（表2）可以看出，不同濃度激素對百香果莖段愈傷組織的誘導具有較大的差異，其中處理3的出愈率最高，為83.33%，愈傷組織為綠色，顆粒狀較密實，有部分芽點和不定芽分化（圖1）。在低濃度時，隨著6-BA濃度的升高，愈傷組織的出愈率逐漸增加，當6-BA濃度為1.5 mg/L時，愈傷組織的出愈率達到最高；隨著6-BA濃度的繼續增加，愈傷組織的出愈率開始下降。通過比較得出，百香果莖段愈傷組織誘導的適宜培養基為：MS培養基+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖 20 g/L+瓊脂 7 g/L。

表2 不同濃度激素處理對莖段愈傷組織誘導的影響

圖1 愈傷組織的誘導

2.2 不同處理對百香果愈傷組織不定芽誘導分化的影響

在莖切面愈傷組織誘導分化成苗的試驗過程中發現，愈傷組織的分化較愈傷組織的誘導難度更高，愈傷組織誘導分化不定芽是本研究的最難點。根據正交試驗極差分析和方差分析可知，6-BA添加量、NAA添加量、土豆泥用量3種因素對芽誘導率的影響達到極顯著水平（表3、表4）。影響芽誘導率高低的因素主次順序為：6-BA添加量＞NAA添加量＞土豆泥用量。理論最優組合為A2B1C3，即以MS培養基+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+土豆泥200 g/L +蔗糖20 g/L組合的芽誘導效果最好，其不定芽誘導率為46.70%。愈傷組織誘導分化出不定芽的效果見圖2。

表3 不定芽誘導的正交試驗結果分析

表4 各指標方差分析結果

圖2 愈傷組織誘導分化不定芽

2.3 不同激素處理組合對不定芽誘導生根成苗的影響

由表5可以看出，在培養基中添加3種不同濃度的IBA和NAA 0.2 mg/L組合，均能誘導生根，但不同處理組合對生根誘導的效果存在一定的差異。在3個處理中，以IBA 1.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L組合的誘導生根效果最好，生根率達93.33%。該組合與其他處理相比，根系較粗壯，根多且長（圖3）。

表5 不同激素處理組合對不定芽誘導生根成苗的影響

圖3 不定芽誘導生根成苗

2.4 病毒檢測

通過RT-PCR檢測技術，由龍巖市農業科學研究所提供的20份百香果組培苗樣品（編號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1A、1B、2A、2B、2C、3A、3B、4A、4B、4C）的病毒檢測結果（圖4）為：所有樣品均未檢測到EAPV和PLV；樣品編號1、2A、2B檢測到PaMV；樣品編號3B檢測到TeMV；樣品編 號1、2、8、9、1A、1B、2A、2B、3A、3B、4B均 檢測到CMV。送檢的20份百香果組培苗樣品有9份均不帶CMV、EAPV、PLV、PaMV和TeMV等5種病毒，脫毒率為45%。

圖4 福建百香果3號的病毒檢測跑膠圖

2.5 不同處理對百香果脫毒組培苗擴繁的影響

由表6可以看出，百香果莖節在MS培養基+6- BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L的組合中的脫毒苗生長效果較佳，表現為：株高8.03 cm，莖粗0.58 cm，鮮重0.42 g；經過40 d左右可發育成6～10 cm高的完整植株。培養一批脫毒苗的周期為40～50 d。

表6 不同激素配比對百香果組培苗擴繁的影響

3 結論與討論

在福建百香果3號愈傷組織的誘導試驗中，以MS培養基+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂7 g/L的組合誘導效果最好，其誘導出愈率為83.33%；在愈傷組織誘導分化不定芽中，以MS培養基+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+土豆泥200 g/L+蔗糖20 g/L的組合誘導效果最好，其不定芽誘導率為46.70%；在不定芽誘導成苗中，MS基本培養基+IBA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的組合誘導生根效果最好，生根率達93.33%；在脫毒苗快繁培養中，以MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L組合的效果最好，表現為生根快、莖粗壯，幼苗長勢好。在上述試驗中，愈傷組織誘導分化不定芽是難點，也是百香果離體培養得到脫毒組培苗的關鍵技術。本研究中，愈傷組織的分化較愈傷組織的誘導難度更高，愈傷組織分化不定芽的誘導率最高為46.70%，顯著低于愈傷組織的出愈率（83.33%）。梁春輝等［12］在研究百香果莖段愈傷組織誘導分化的試驗中，愈傷組織的最高誘導率為70.00%，愈傷組織誘導不定芽的誘導率最高為40.00%。孫琪等［10］在研究百香果組織培養技術研究中，莖段愈傷組織的最高誘導率為66.67%，愈傷組織不定芽的誘導率最高為55.56%。從研究結果可以看出，愈傷組織再分化不定芽的誘導率顯著低于愈傷組織的誘導率，說明百香果愈傷組織誘導分化不定芽的相關方法還有待進一步研究，從而實現誘導分化率的提高。

在病毒檢測試驗發現，20份百香果組培苗樣品中有9份均不含CMV、PaMV、TeMV、EAPV和PLV，脫毒率達到45%。這說明如果組培快速繁苗的速度足夠快，利用百香果莖段愈傷組織為外植體建立再生體系獲得脫毒組培苗這項技術完全可以滿足保存優良種質資源和培育工廠化優質脫毒種苗的需求。但愈傷組織脫毒方法的缺陷是植株遺傳性狀存在不穩定性，可能會產生變異植株［13］，在后續研究中將重點觀察評價脫毒苗的田間表現。